【摘要】：酚類污染物是現(xiàn)代化工業(yè)社會生產(chǎn)中的常見污染物之一,利用微生物對酚類污染物的降解是一種環(huán)境友好型的處理方法,微生物對酚類污染物脅迫的耐受機制一直是科研人員關(guān)注的焦點。研究不同微生物菌株對酚類化合物的耐受及生物降解機制,有利于對菌株進行耐受與降解策略的改造,對于開發(fā)新的有效的酚類污染物修復(fù)技術(shù)具有重要意義。本實驗以篩選到的一株洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia BNS)為供試菌株,運用傳統(tǒng)微生物實驗方法考察了菌株的生長及降酚性能。構(gòu)建洋蔥伯克霍爾德菌BNS的苯酚脅迫體系,并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和蛋白組學(xué)(Label-free)技術(shù)對苯酚脅迫0 h、2 h、12 h、24 h菌株的mRNA樣品和蛋白樣品進行測序分析,通過差異基因與差異蛋白的GO與pathway富集分析,闡明洋蔥伯克霍爾德菌BNS應(yīng)答苯酚脅迫的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平的響應(yīng)機制,并對脅迫及降解相關(guān)的關(guān)鍵酶進行了異源表達嘗試,具體獲得了如下結(jié)果:1.洋蔥伯克霍爾德菌(B.cepacia BNS)具有較強的抗逆性能,在pH 4~10生長良好,80℃處理30 min,菌株仍然能夠存活。菌株通過胞外木質(zhì)素過氧化物酶和胞內(nèi)漆酶對合成染料進行脫色,同時對苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、β-萘酚都具有降解作用,菌株對苯酚的最大耐受濃度為1.5 g/L,且在低濃度下可能通過羥化途徑降解,在高濃度下可能通過羥化和羧化途徑同時進行苯酚的代謝。2.利用mRNA-Seq對1.5 g/L苯酚脅迫下0 h、2 h、12 h、24 h的mRNA樣品進行轉(zhuǎn)錄本測序,共得到7614個表達基因,5691個顯著差異表達基因。通過差異基因的GO與Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),在脅迫初期菌株主要通過降低自身的代謝活性,提高EnvZ/OmpR、外排泵、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、DNA修復(fù)蛋白、超氧化物歧化酶SOD、冷激蛋白、谷胱甘肽GSH、漆酶等功能和應(yīng)激基因的表達來增強對苯酚的耐受。脅迫中期碳源饑餓因子CST與苯酚代謝通路相關(guān)基因表達上調(diào)明顯,外排泵、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等繼續(xù)保持高表達狀態(tài),應(yīng)激相關(guān)基因表達下調(diào)。在脅迫后期,菌株處于活躍生長狀態(tài),苯酚代謝速度加大,此階段苯酚降解相關(guān)酶、氧化磷酸化、分子伴侶、外膜蛋白、降解蛋白等高水平表達。菌株在不同時刻通過調(diào)控通路基因的轉(zhuǎn)錄水平來應(yīng)答苯酚的脅迫和毒害,并由初期的被動耐受轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃诘闹鲃咏到?且主要通過β-酮己二酸途徑對苯酚進行降解。3.對苯酚脅迫下菌株轉(zhuǎn)錄因子和小RNA(small RNA)的差異表達情況進行了分析。獲得10個家族共計461個轉(zhuǎn)錄因子信息,并在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)控作用,其中LysR家族轉(zhuǎn)錄因子主要參與DNA損傷修復(fù)、苯酚耐受及苯酚的降解過程;AraC家族、TetR轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控外排泵的表達、滲透壓調(diào)控等作用;Sigma因子通過σ70家族基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和σ54家族調(diào)節(jié)碳氮代謝以及anti-sigma因子的作用來調(diào)控菌株對苯酚的耐受及降解;GntR家族主要調(diào)節(jié)菌體自身的生長代謝和膜相關(guān)蛋白的表達;MarR家族與胞內(nèi)氧化應(yīng)激的反應(yīng)相關(guān);IclR家族在原兒茶酚等芳香酚的降解調(diào)控方面具有重要作用;LuxR家族主要調(diào)控了菌株的群體感應(yīng)、生物膜及毒力因子的表達;FnR家族與XylR家族蛋白調(diào)控了菌株的氧感應(yīng)壓力及有機物的代謝。另外還獲得了484個sRNA的基因信息,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控1501個mRNA,形成了16760對sRNA-mRNA靶向調(diào)控關(guān)系。通過sRNA富集分析發(fā)現(xiàn),sRNA的調(diào)控作用主要參與了運轉(zhuǎn)RNA的乙酰化、甘油磷脂代謝、蛋白代謝與激活、磷脂酰肌醇代謝等生物過程。4.利用非標記定量蛋白組學(xué)(Label-free)技術(shù)對苯酚脅迫下的菌體蛋白表達差異進行鑒定分析,共鑒定出3194個蛋白信息,顯著差異的蛋白有1104個,其中表達差異蛋白684個,有無差異蛋白420個。經(jīng)過GO功能分析發(fā)現(xiàn),差異表達蛋白的功能主要分布在催化活性,結(jié)合功能,轉(zhuǎn)運活性,分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控,主要參與了代謝過程、細胞過程、細胞定位、苯甲酸降解、生物調(diào)控等重要生物學(xué)過程。菌株通過調(diào)控多種功能的膜蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、應(yīng)激響應(yīng)蛋白的差異表達來提高對苯酚的耐受,通過調(diào)控苯酚β-酮己二酸途徑中的ortho支路和原兒茶酚代謝支路來降解苯酚,以減少苯酚對細胞的毒性。5.構(gòu)建了以pET32a為載體的原核表達體系,對洋蔥伯克霍爾德菌BNS類漆酶進行了大腸桿菌表達,成功獲得了一個分子量為30 kDa左右的目的蛋白,此蛋白以二聚體的形式發(fā)揮活性,純化后以ABTS為底物的比活性為7.81 U/mg,Km和kcat分別為156.4μM和619.44 s~(-1),催化效率為3.96μM~(-1) s~(-1);以2,6-DMP為底物的比活性為12.3U/mg,Km和kcat分別為100.2μM和1162.22 s~(-1),催化效率為11.60μM~(-1) s~(-1),同時能對多種合成染料進行脫色。另外,利用畢赤酵母Ppic9K載體與GS115分泌表達系統(tǒng)對洋蔥伯克霍爾德菌中兒茶酚1,2-雙加氧酶(cat12)進行了分泌表達嘗試,在胞外成功獲得了一個分子量為35 kDa的蛋白,該蛋白以鄰苯二酚為底物時的活性為22.55U/mg。
【圖文】：

不動桿菌（Acinetobactersp.）在苯酚脅迫下的分子響應(yīng)（Lin2017）

產(chǎn)乙醇細菌對抑制劑的耐受及適應(yīng)機制（IbraheemandNdimba2013）
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X703
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本文編號：2655280