【摘要】：隨著環(huán)境科學的日益發(fā)展,環(huán)境中的微生物對人類社會的影響越來越受到重視,尤其是環(huán)境中的致病微生物,容易導致人類疾病和社會恐慌,因此成為了環(huán)境生物分析領域的研究熱點之一。目前,環(huán)境科學已經與化學、生物和微流控等多種技術交叉融合,通過充分發(fā)揮各學科的技術優(yōu)勢,極大的促進了環(huán)境微生物分析檢測的發(fā)展。其中,分子生物學分析具有操作簡單、靈敏性和特異性高的特點。但是,受到儀器、樣品和試劑的使用及成本的限制,在對多種樣品進行大量分析時,存在著操作繁瑣和成本較高等問題,而且無法滿足現(xiàn)場實施分析的需要。因此,亟需一種快速、便攜、高通量的檢測技術,用于環(huán)境致病微生物的現(xiàn)場監(jiān)測和分析。本論文通過微流控芯片技術和分子生物學技術的結合,以PDMS為材料,構建了一種簡單廉價的連續(xù)流動式PCR擴增芯片,可以對環(huán)境微生物進行快速檢測。一次擴增需要的樣品和PCR試劑消耗量分別約為0.1ul和2ul。與傳統(tǒng)的PCR方法相比,本芯片結構簡單,便于攜帶,可以對多個樣品進行流動式分析,而且操作簡便,能夠初步滿足現(xiàn)場檢測的需要。在此基礎上,我們構建了用于空氣中微生物檢測的高通量流動式PCR芯片。通過閥門的開啟和閉合,對反應液的流動進行控制,實現(xiàn)了以連續(xù)流動進樣的方式一次針對六種空氣中的微生物的檢測。從細菌的富集和裂解到芯片PCR擴增完成,耗時約2小時,一次分析需要的樣品量僅為013ul, PCR反應試劑約2.5ul,特別適合對珍貴或稀少樣品的分析。以大腸桿菌為目標菌株,測得該芯片的最低檢測限約為118個細菌。本研究構建的微流控芯片是首個具有直接針對空氣中的微生物進行分子生物學分析能力的設備,在對環(huán)境氣溶膠中的病原微生物的快速分析中將發(fā)揮重要作用,通過改進和完善,有望實現(xiàn)環(huán)境空氣微生物的現(xiàn)場檢測和早期預警。為了進一步滿足高通量檢測的需要,提高檢測特異性,我們在常規(guī)基因芯片技術的基礎上,構建了基于微流控的靜態(tài)核酸雜交芯片。通過設計針對細菌16SrDNA可變區(qū)的寡核苷酸探針,可以實現(xiàn)一次對五種常見環(huán)境致病微生物的快速雜交分析。探針的特異性較好,最低檢測限與常規(guī)的基因芯片技術相當,但試劑消耗和反應耗時分別約為常規(guī)方法的10%和50%。我們通過將連續(xù)流動式PCR芯片與核酸雜交芯片進行整合,開發(fā)了快速、便攜和成本低廉的微生物核酸分析系統(tǒng)。本研究是環(huán)境科學與生物醫(yī)學研究院的交叉聯(lián)合項目,通過環(huán)境生物學技術和微流控技術的結合,對環(huán)境微生物進行分析和檢測,為環(huán)境科學的發(fā)展提供新的技術支持。另外,本研究所構建的微流控芯片系統(tǒng)在對環(huán)境中其它微生物的檢測中也能發(fā)揮出獨特的優(yōu)勢,具有較高的理論和應用價值。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X835

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 劉毅,韓金祥,朱波,黃海燕;Parallel Detection of Bacterial Pathogens in Cerebrospinal Fluid with 16S rRNA Probe Microarray[J];Journal of Microbiology and Immunology;2004年03期

2 陳立杰;劉振世;董邦權;楊琨;李琦;金伯泉;;酶聯(lián)免疫發(fā)光法檢測金葡菌腸毒素(SE)B和SEC1方法的建立[J];細胞與分子免疫學雜志;2006年05期

3 陳廣全;曾靜;張惠媛;魏海燕;臧慶偉;汪琦;饒紅;張昕;張西萌;;食源性致病病毒基因芯片方法檢測[J];中國公共衛(wèi)生;2008年05期

4 靳連群,李君文,王升啟,晁福寰,王新為;基因芯片技術檢測環(huán)境中常見致病菌的初步研究[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年01期

，

本文編號：2640337