【摘要】：有機(jī)磷酸酯阻燃劑(organophosphate flame retardants,OPFRs)是一類廣泛使用的磷系阻燃劑,由于OPFRs容易被釋放到環(huán)境中且具有毒性效應(yīng),對環(huán)境和人體健康構(gòu)成了潛在威脅,近年來已受到人們的普遍關(guān)注。然而目前關(guān)于OPFRs的微生物降解性能和機(jī)制的研究還相對較少。本文以磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPHP)作為OPFRs的代表污染物,利用短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)為實(shí)驗(yàn)菌株,研究了B.brevis對TPHP的降解特性和轉(zhuǎn)化機(jī)制以及菌體在TPHP脅迫下的蛋白表達(dá)變化,此外還分析了TPHP及其降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性效應(yīng)和作用機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:(1)B.brevis可以有效降解TPHP并且利用TPHP作為碳源和能源生長,菌體對TPHP的降解效果與投菌量,溫度和體系pH值有關(guān),當(dāng)溫度為30℃,pH值為7.0時(shí),2 g/L的B.brevis在5 d內(nèi)對TPHP(1 mg/L)的降解率達(dá)到92.1%,在此過程中降解體系的pH值也隨時(shí)間增加逐漸降低。B.brevis對較低濃度(≤10 mg/L)的TPHP處理4 d后降解率可達(dá)80%以上,而高濃度(50 mg/L)的TPHP則會破壞菌體細(xì)胞正常的形態(tài)結(jié)構(gòu),造成細(xì)胞破損,導(dǎo)致其降解率僅為26.9%。利用B.brevis生物強(qiáng)化修復(fù)河水體系中的TPHP,顯著減少了TPHP降解過程的遲滯期,處理96 h后TPHP的降解率達(dá)到97.9%。這些結(jié)果表明生物強(qiáng)化可以作為一種原位修復(fù)TPHP污染水體的潛在方案。(2)在B.brevis降解TPHP的過程中,利用LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜共檢測到7種TPHP的代謝產(chǎn)物,包括DPHP,PHP,單羥基TPHP,單羥基DPHP,單羥基PHP,雙羥基TPHP和雙羥基DPHP。根據(jù)代謝產(chǎn)物推測TPHP的降解途徑,主要涉及水解和羥基化過程。DPHP和PHP的含量隨著TPHP的降解逐漸累積,反應(yīng)5 d內(nèi)最高濃度分別達(dá)到77.1和2.1μg/L。此外B.brevis對1 mg/L的DPHP和PHP也具有一定的降解效果,處理5 d后最高降解率分別為14.4%和23.3%。B.brevis在TPHP的脅迫下引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高,同時(shí)誘導(dǎo)SOD和CAT活性增大。細(xì)胞色素P450酶抑制劑胡椒基丁醚顯著抑制了B.brevis對TPHP的降解效果以及菌體P450酶基因的表達(dá),并且這種抑制作用隨胡椒基丁醚濃度的增加而增強(qiáng),表明P450酶可能參與了TPHP的生物降解過程。(3)基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)分析B.brevis在TPHP暴露下的蛋白表達(dá)差異,其中有102個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),80個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。這些差異蛋白的功能主要集中于運(yùn)輸與代謝,信息存儲與處理,細(xì)胞過程與信號等。TPHP刺激了B.brevis的碳水化合物代謝,導(dǎo)致參與糖酵解過程的蛋白表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào),同時(shí)TPHP還通過增強(qiáng)菌體的氨基酸和脂質(zhì)代謝過程,為細(xì)胞的生長代謝活動提供更多的能量。參與裝配50S和30S亞基的核糖體蛋白在TPHP的暴露下表達(dá)顯著上調(diào),對于菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成具有重要作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和抗氧化應(yīng)激蛋白在TPHP脅迫下也表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。B.brevis在環(huán)境壓力下通過調(diào)控不同功能蛋白的表達(dá)維持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定同時(shí)增強(qiáng)了菌體對TPHP的適應(yīng)性。(4)TPHP及其降解產(chǎn)物DPHP和PHP均對HepG2細(xì)胞的活力產(chǎn)生了不同程度的抑制作用,其中TPHP的抑制效果最強(qiáng),PHP最弱。TPHP暴露濃度增大可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)含量顯著增加,破壞了線粒體膜的完整性促使ROS在細(xì)胞內(nèi)積蓄,引起了細(xì)胞氧化應(yīng)激,進(jìn)一步造成細(xì)胞線粒體膜電位下降,從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。高濃度(≥100μmol/L)的TPHP還會導(dǎo)致細(xì)胞核損傷固縮。DPHP和PHP對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用相比TPHP要明顯減弱。此外,TPHP能使HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,減少了S期細(xì)胞的比例。與DPHP和PHP相比,TPHP對HepG2細(xì)胞的毒性效應(yīng)最強(qiáng),DPHP次之,且具有一定的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明TPHP及其降解產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞的毒性與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)�？偟膩碚f,生物降解消減了TPHP的毒性作用,是一種有效和安全的TPHP污染修復(fù)方法。本研究有助于從蛋白水平和毒理學(xué)角度揭示微生物降解轉(zhuǎn)化TPHP的機(jī)制,以及TPHP及其降解產(chǎn)物可能對環(huán)境和人體健康產(chǎn)生的毒害作用,為開發(fā)OPFRs污染的微生物修復(fù)技術(shù)提供了數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X592;X171.5

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