【摘要】：吲哚及其衍生物是焦化廢水中典型的氮雜環(huán)化合物,利用微生物法能將其轉化為靛藍、靛玉紅等常見色素,不僅能實現(xiàn)廢水中吲哚的有效處理,而且能夠合成有工業(yè)應用價值的化合物,具有環(huán)境與經(jīng)濟的雙重效益。目前,靛藍類色素的微生物合成多數(shù)集中在純菌(野生菌或重組大腸桿菌)的研究,但分離的菌屬種類相對單一,主要為Pseudomonas屬,而有關微生物群落合成靛藍類色素的研究尚未見報道。本論文從野生菌、重組大腸桿菌以及活性污泥體系三個方面對微生物合成靛藍類色素的特性進行研究,主要內(nèi)容如下： 針對靛藍合成菌屬資源相對匱乏的現(xiàn)狀,有必要篩選新型的菌株。分別采用萘+吲哚(G1)和苯酚+吲哚(G2)對活性污泥體系進行馴化,結果發(fā)現(xiàn)不同芳香化合物刺激的污泥體系均能轉化吲哚合成靛藍,且G1具有更好的靛藍合成能力,并從中篩選得到靛藍產(chǎn)生菌MQ。由16S rRNA基因序列分析表明菌株MQ歸屬于Comamonas屬,是一株新穎的靛藍產(chǎn)生菌。分別考察菌株MQ生長細胞和休眠細胞轉化吲哚合成靛藍的基本特性,結果發(fā)現(xiàn)：生長細胞合成靛藍的最適吲哚濃度為50mg/L,萘濃度為200mg/L,得到的靛藍產(chǎn)量為32.2mg/L；休眠細胞合成靛藍的最適溫度為25℃,搖床轉速為150r/min,菌量為OD6602.16,吲哚濃度為201mg/L,反應體系pH為6.9,生成的靛藍為53.1mg/L。利用薄層色譜、液相色譜-質譜聯(lián)機等分析手段對菌株MQ轉化吲哚合成的產(chǎn)物進行鑒定,結果表明合成的藍色產(chǎn)物為靛藍,并推測可能的代謝途徑：吲哚在萘雙加氧酶的催化下生成順式-吲哚-2,3-二氫二醇,后者自發(fā)脫水形成吲哚酚,兩分子吲哚酚在空氣中氧化二聚生成靛藍。 利用熱不對稱交錯PCR和同源擴增的方法從菌株MQ的基因組DNA中成功擴增到完整的萘雙加氧酶編碼基因,全長約為5.2kbp。對萘雙加氧酶基因進行序列分析,結果表明其為nag型基因簇,基因排列順序為：nagAa-nagG-nagH-nagAb-nagAc-nagAd。將該基因導入到Escherichia coli BL21(DE3)中,構建重組大腸桿菌ND_IND,利用SDS-PAGE分析及粗酶活性檢測表明萘雙加氧酶得到成功表達。重組大腸桿菌ND_IND能夠轉化吲哚、甲基吲哚、硝基吲哚、氯代吲哚等多種吲哚衍生物合成不同顏色的物質,利用紫外-可見全波長掃描、液相色譜-質譜聯(lián)機等分析手段對轉化產(chǎn)物進行鑒定,結果表明生成的主要產(chǎn)物為含有不同取代基的靛藍類色素。 考察重組大腸桿菌ND_IND轉化吲哚及色氨酸合成靛藍類色素的基本特性。以吲哚為底物時,菌株ND_IND合成靛藍的最適條件為：菌量OD6002.50,吲哚濃度300mg/L,葡萄糖濃度30g/L,反應體系pH7.0,在此條件下靛藍產(chǎn)量為205.1mg/L�？疾旖饘匐x子以及典型焦化廢水組分對靛藍合成的影響,結果發(fā)現(xiàn)大部分金屬離子以及喹啉對靛藍合成具有明顯的抑制作用。以色氨酸為底物時,菌株ND_IND合成靛藍類色素的最適萘雙加氧酶誘導條件為：誘導時間點OD6001.20, IPTG濃度0.50mmol/L,誘導溫度30℃；利用表面響應法對色氨酸培養(yǎng)基進行優(yōu)化,分別得到150.2mg/L靛藍和9.4mg/L靛玉紅；為進一步提高靛玉紅的產(chǎn)量,在培養(yǎng)基中額外投加2-吲哚酮和靛紅,結果發(fā)現(xiàn)誘導1h后加入500mg/L2-吲哚酮能得到58.0mg/L靛玉紅,產(chǎn)量提高了6.2倍。 將野生菌MQ(B2)以及重組大腸桿菌ND_IND (B3)投加到活性污泥體系中,首次對活性污泥體系合成靛藍的特性進行研究。結果表明,菌株強化組B2與B3的靛藍產(chǎn)量明顯高于對照組(B1),且B3合成的靛藍產(chǎn)量最高。采用Illumina高通量測序技術對微生物群落進行分析,結果顯示強化菌MQ在污泥體系中能維持一段時間,而強化菌ND_IND則基本不能生存。QPCR分析顯示萘雙加氧酶基因(nagAc)在運行初期與靛藍產(chǎn)量具有顯著的正相關,表明強化菌在初期靛藍合成中起著重要的作用。降趨勢對應分析和非參數(shù)檢驗表明,三組體系的微生物群落結構在運行過程中發(fā)生了顯著的變化。Comamonas、Alcaligenes、Aquamicrobium和Pseudomonas是三組體系中主要的菌屬(平均豐度1%),其中典型的靛藍產(chǎn)生菌Comamonas和Pseudomonas與靛藍產(chǎn)量沒有明顯的正相關,而Alcaligenes和Aquamicrobium與靛藍產(chǎn)量則存在顯著的正相關,這些菌屬在靛藍合成研究中并未有相關報道,可能是新型的靛藍產(chǎn)生菌。
【圖文】：

德國BASF公司利用生命周期評價方法（LCA)對不同靛藍合成方法進行了生態(tài)效益分析，結果如圖1.2所示EncruAconsii mption./ v'lU ? \ Materials liuhuo frmn plantsLniissMMi#C 廣\ \ ll / Iiuliuo f'niMi cliciiik'iil sMithcsiNV / \ / /V \ / \ / / Indigo from hiutechnuln^icalV* j/ \y' / pnuliictiiHi ^ Riskixik'iilial l)"l ⑶圖1.2不同靛藍合成方法的生態(tài)效益分析Fig. 1.2 Eco-efficiency analysis of different types of indigo production-3-

典型的單加氧酶如細胞色素P450單加氧酶、苯酷經(jīng)化酶、黃素單加氧酶、甲苯單加氧酶等（圖1.4);根據(jù)加氧酶組成成分的不同，這些酶可以劃分為多組分酶和單組分酶，其中萘雙加氧酶、苯酴輕化酶、甲苯單加氧酶等為多組分酶系，細胞色素P450單加氧酶、黃素單加氧酶等為單組分酶系（圖I.4)P3-39.40,42.44,65]^研究人員利用構建的重組大腸桿菌對這些功能酶進行外源表達，進而用于靛藍類色素的合成，在靛藍合成機理、條件優(yōu)化等方面^u展了大量的工作。nail{55^thn DioxygenascMonooxygenaseMX): Niiphtlialeiic (li"\ygt‘iiast- IJphA: Biplienvl dioxvociu'iise l liriA: Tctraliii ilioxygcnase _I PHO: Pheiiol hydroxylase TMO: Ibluenc monooxygenase KMC): Flavin inoiiooxygeiiases ■1*450: ( ytochioiiie P45i) monooxygenascs .圖1.4典型的歐藍合成功能酶及其編碼基因簇Fig. 1.4 Typical enzymes and the corresponding gene clusters responsible for indigo production(1)萘雙加氧酶萘雙加氧酶是最早應用于敲藍類色素合成的加氧酶。萘雙加氧酶（EC 1.14.12.12)，又名萘-1,2-雙加氧酶，是一類多組分雙加氧酶，通常包含一個NADH氧化還原酶、一個鐵氧化蛋白和一個包含活性位點的鐵-硫蛋白[66，，67]。萘雙加氧酶也是一類典型的Rieske型非血紅素鐵加氧酶，催化主體部分由大亞基和小亞基（又名a亞基和A亞基）構成一個《3/?3的六聚體結構，其中大亞基含有一個Rieske型[2Fe-2S]中心和一個非血紅素單-9-
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X784;X172

【參考文獻】

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本文編號：2611004