【摘要】：近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用治療各類感染,使細(xì)菌耐藥問題越來越嚴(yán)重,從而導(dǎo)致了細(xì)菌多重耐藥性(Multidrug resistance, MDR)的現(xiàn)象。不斷的濫用抗生素使得人體乃至自然環(huán)境為細(xì)菌進(jìn)化為多重耐藥性細(xì)菌提供了選擇壓力并使細(xì)菌耐藥性得以廣泛的傳播。整合子是一種可移動(dòng)元件,在整合酶作用下,識(shí)別重組位點(diǎn),通過位點(diǎn)特異性重組剪切、捕獲并整合細(xì)胞外游離的基因盒,并借助整合子的強(qiáng)啟動(dòng)子使功能性基因得以表達(dá)的遺傳系統(tǒng)；整合子的基因盒大部分是具編碼多種水解酶或修飾酶、外排泵等與細(xì)菌耐藥性相關(guān)基因。 臨床上具有不同耐藥基因的致病菌會(huì)以各種方式流入環(huán)境中,環(huán)境細(xì)菌通過基因的水平轉(zhuǎn)移,可以從流入環(huán)境中的臨床致病菌中獲得耐藥性基因。在耐藥基因轉(zhuǎn)移過程中,往往會(huì)發(fā)生突變或重組,進(jìn)而產(chǎn)生新的耐藥基因或新的多重耐藥性基因的組合。反過來,這些新的耐藥因子有可能再從環(huán)境細(xì)菌轉(zhuǎn)入臨床致病菌,經(jīng)過空氣、食物或水來感染人體,在臨床上產(chǎn)生耐藥性,對(duì)人類健康具有極大的危害。在抗菌藥物選擇壓力環(huán)境下,整合子隨轉(zhuǎn)座子、接合性質(zhì)粒一同發(fā)生水平轉(zhuǎn)移具有使耐藥性在細(xì)菌之間傳播的功能,是細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)生存、適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制之 也是耐藥性傳播的重要途徑。 我們這項(xiàng)研究是通過調(diào)查濟(jì)南地區(qū)醫(yī)院周邊生活廢水中整合子細(xì)菌的發(fā)生率以及其含有的耐藥基因盒結(jié)構(gòu),目的是發(fā)掘、鑒定一些新型的整合子結(jié)構(gòu)。從基因水平上分析細(xì)菌的耐藥及其轉(zhuǎn)移的機(jī)制,說明抗菌藥物濫用的危害性從而指導(dǎo)抗菌藥物的正確使用,防止抗菌藥物的濫用；根據(jù)細(xì)菌耐藥的機(jī)制,有目的的開發(fā)一些新型抗菌藥物。 本文主要的工作內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.通過濾法從濟(jì)南市區(qū)廢水環(huán)境中篩選耐藥性細(xì)菌,對(duì)所有耐藥性菌株的1型、2型、3型整合酶通過PCR分別進(jìn)行檢測(cè) 從2008年至2009年各大醫(yī)院廢水處理廠周邊的廢水樣品；濟(jì)南齊魯制藥廠下游小清河地下水、工程改造地下抽去的排水及藥廠豬圈廢水；廢水處理廠處理前廢水及部分天然少污染的濟(jì)南周邊泉水共15個(gè)不同時(shí)間的樣品進(jìn)行分析。篩選出391株不同耐藥性腸桿菌菌株,根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn),通過抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)分析菌株對(duì)常用抗菌藥物耐藥性,發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)氨芐西林、甲氧芐啶、硫代異唑的耐藥性大于85%。通過1、2、3型整合酶引物intI1F/R,intI2F/R和intI3F/R進(jìn)行PCR檢測(cè),其中1型整合子比率為59.3%,2型整合子的比率為9.2%,未篩選到3型整合酶陽性的菌株。391株菌株藥物敏感性結(jié)果與整合子篩選結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),含有整合子的耐藥細(xì)菌對(duì)氨芐西林、甲氧芐啶和硫代異唑三種抗菌藥物的耐藥率高達(dá)90%以上,非整合子細(xì)菌氨芐西林的耐藥性也高達(dá)87.2%,除了磷霉素外,耐藥性含整合子細(xì)菌比不具有該結(jié)構(gòu)的菌株耐藥性的比率高10%-20%。 2.對(duì)1型整合子可變區(qū)采用PCR擴(kuò)增,通過PCR產(chǎn)物大小、PCR產(chǎn)物RFLP圖譜分析及測(cè)序結(jié)果機(jī)型分析 根據(jù)1型整合子可變區(qū)根據(jù)其保守的5'CS和3'CS設(shè)計(jì)引物hep58,hep59進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小從0.2kb至6.3kb,PCR產(chǎn)物EcoRⅡ酶切圖譜分析,發(fā)現(xiàn)34種不同酶切圖譜,測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)35種不同的基因盒陣列,具有42種不同的基因盒。35種基因盒陣列中九種基因盒陣列屬于新的排列組合,16SrRNA分析,九株菌包含6個(gè)屬：氣單胞菌屬、克雷伯菌屬、大腸桿菌屬、從毛假單胞菌屬、普羅維登斯菌屬和奇異變形桿菌屬。9種新型基因盒陣列如下所示：orfI；arr3--dfrA27；aadA△16—acc(6')-Ⅱ；aac(6')-Ib—bIaoXA-1—catB3；aacA4—orfun—aacA4—catB3 dhfrV—aac.(6—Ⅱ—nitr1—nit2—catB3—blaOXA-1；aac(6')-Ib-cr—arr3—dfrA27—aadA16—IS26；aadB—cat—blaOXA-10—aadAl—dfrAl—aacA4；aadB—cat—blaOXA-10—aadAl—orfll.232株具有1型整合子的基因盒陣列中,dfrA17—aadA5排列方式是最多的一種,占43.5%,其次是dfrA12—orfF—aadA2陣列,占19.3%。 3.對(duì)共篩選出36株2型整合子進(jìn)行分析,其中含有5種不同的基因盒排列組合,接合轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)化方法分析2型整合子的水平轉(zhuǎn)移性 用于擴(kuò)增2型整合子可變區(qū)hep74和hep51引物成功擴(kuò)增到5種不同的PCR產(chǎn)物4.3kb,3.0kb,2.5kb和2.2kb及時(shí)隱時(shí)現(xiàn)的2.5kb片段大小。PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T測(cè)序結(jié)果顯示分別為linF—dfrAl—aadAl—orf441；dfrA1—catB2—sat2—aadA1; estXvr—sat—aadA1; dfrA1—sat2—aadA1及雜合型的dfrA1—sat2—aadA1—qacH基因盒陣列。36株2型整合子細(xì)菌根據(jù)REP圖譜進(jìn)行分類,發(fā)現(xiàn)其可以分為15類,16S rRNA測(cè)序結(jié)果顯示19株屬于奇異變形桿菌屬,大腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬各7株,費(fèi)氏檸檬酸桿菌、志賀氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬各1株。接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及脈沖場(chǎng)電泳及Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除E.coli C4雜合型2型整合子外,其余新型2型基因盒陣列均位于染色體上。采用Tn7類轉(zhuǎn)座子特有序列tnsD, tnsE進(jìn)行檢測(cè),除2株雜合型2型整合子不具有此類保守序列外,其余34株2型整合子均屬于Tn7轉(zhuǎn)座子家族。在雜合型2型整合子下游鑒定存在IS26, tnp440和sul3基因。 4. Aeromonas puctata中新型喹諾酮耐藥性基因qnrVC4的克隆及活性分析 從Aeromonas puctata基因盒3.3kb aacA4—orfun—aacA4—aatB3比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中間lkb序列功能未知,具有218氨基酸的開放閱讀框,GenBank比對(duì)結(jié)果顯示其與QnrB6, QnrA1, QnrS1, QnrC, QnrVC1和QnrVC3具有45%-81%的相似性。根據(jù)核苷酸、氨基酸序列相似性及其attC重組位點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的分析,根據(jù)qnr基因命名的法則,將此基因命名為qnrVC4。接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均未獲得該菌株相應(yīng)的轉(zhuǎn)移子。采用堿裂解法提取質(zhì)粒,脈沖場(chǎng)電泳,23S rRNA探針雜交對(duì)染色體定位,然后用qnrVC4探針進(jìn)行雜交分析,結(jié)果表明該基因位于 大質(zhì)粒上,并且該質(zhì)粒不可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。利用pBC KS(+)的Lac啟動(dòng)子及整合子本身的啟動(dòng)子PcWTGN-10進(jìn)行表達(dá)。將657bp的qnrVC4及含有啟動(dòng)子、aacA4、qnrVC4基因的1.8kb的PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pBC KS(+)中,在E.coli Top 10中成功構(gòu)建重組子pBCKS-qnrVC4和pBCKS-Pt-qnrVC4。重組子pBCKS-qnrVC4對(duì)環(huán)丙沙星、加替沙星、萘啶酮酸最小抑菌濃度(MICs)結(jié)果分別為0.032,0.047和4 gg/mL；重組子pBCKS-Pt-qnrVC4結(jié)果分別為0.008,0.006和2μg/mL。分析此菌株染色體上GyrA, GyrB和ParC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域(QRDR)發(fā)現(xiàn)GyrA Ser-83-Ile突變是該菌株喹諾酮耐藥性的主要原因。 5.分析391株耐藥細(xì)菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥性基因qnrA, qnrB, qnrS的分布 雖然QnrA, QnrB和QnrS蛋白在喹諾酮耐藥性的貢獻(xiàn)非常小,但是qnrA,qnrB和qnrS通常位于質(zhì)粒上并成為喹諾酮耐藥性水平轉(zhuǎn)移的主要方式,并且此類基因的水平轉(zhuǎn)移為獲得高喹諾酮耐藥性提供可能。從391株篩選的不同耐藥菌株中31株具有qnr類基因,其中2株具有qnrA基因；9株具有qnrS基因陽性菌株；17株qnrB基因陽性菌株,3株同時(shí)含有qnrB, qnrS基因。通過兩對(duì)引物進(jìn)行PCR,并且通過PCR-RFLP的方法對(duì)qnrB基因變體進(jìn)行了詳細(xì)的分析,此分析法的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相一致,可以用來大量快速鑒定qnrB基因變體并發(fā)現(xiàn)新型qnrB變體。與喹諾酮耐藥性相關(guān)的aac(6')-Ib-cr基因與qnr基因同時(shí)存在可以提高喹諾酮耐藥性,在31株菌中檢測(cè)到12株菌具有該基因。與喹諾酮相關(guān)的外排泵基因qepA僅在1株qnrB菌株中和4株qnrS菌株中檢測(cè)到。接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)18株菌株的qnr基因可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。 6.調(diào)查391株耐藥性菌株中ISCR1介導(dǎo)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的1型整合子及具有該元件菌株的耐藥性機(jī)制分析 本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了391株菌株含有ISCR1元件的概率,發(fā)現(xiàn)其中有41株具有ISCR1元件,包括所有含有qnrA, qnrB的菌株。采用ISCR1元件的保守序列設(shè)計(jì)引物513BF和3'CS的qac△EB引物及SEFA-PCR分析ISCR1元件下游所攜帶的耐藥性基因,從中發(fā)現(xiàn)了11種不同的結(jié)構(gòu),包括ISCR1—qnrA—ampR—qac△E—sull, ISCR1—qnrB2—qac△E—sull, ISCR1—qnrB6—qac△E—sull, ISCR1—dfrA10—qac△E—sull, ISCR1—tnpU—armA, ISCR1—dfrL—qac△E—sull, ISCR1—dfrM—qac△E—sull, ISCR1—dfrN—qac△E—sull, ISCR1—dfrA19—intI1—aatB3—aadB—qac△E—sull, ISCR1—blaPER-1—gst—ABC transporter—orf252—qac△E, ISCR1—IS630—blaPER-1—gst—ABC transporter—arf52—qac△E等結(jié)構(gòu)。模擬3種新型的DHFR家族(DfrL, DfrM, DfrN)位于ISCR1元件下游的遺傳結(jié)構(gòu),對(duì)甲氧芐啶最小抑菌濃度進(jìn)行分析,耐藥性均大于1024μg/mL。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：X703

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本文編號(hào)：2590077