本文關鍵詞： RP4質粒 氨氧化菌 序批式反應器 硝化效率 基因表達　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：抗生素耐藥問題嚴重威脅著人類的健康。水環(huán)境中的抗生素抗性基因(Antibiotic resistant genes,ARGs)種類和數量的增多,對環(huán)境和人類健康均造成了一定影響。目前ARGs已經被定義為一種新的環(huán)境污染物。污水中同樣含有大量的ARGs,而污水生物處理系統(tǒng)不僅是抗生素進入環(huán)境的一個重要途徑,同時也是耐藥細菌、ARGs富集,并在環(huán)境中散播的一個重要污染源。污水處理過程中,生物脫氮有著重要的意義。這一過程先由氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)將氨氧化為亞硝酸鹽,再由亞硝酸鹽氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。ARGs作為生物大分子,有可能直接參與細菌的代謝進而影響污水生物處理系統(tǒng)的污染物去除效率。本研究在課題組前期針對RP4質粒水平轉移影響膜生物反應器(Membrane bioreactor,MBR)和顆粒污泥生物反應器(Granular sludge bioreactor,GSBR)硝化效率的基礎上進一步深入探討RP4質粒與AOB間水平轉移及其對AOB代謝影響的分子機制。研究擬構建平行運行的,以硝化反應為主體的序批式反應器(Sequencing batch reactor,SBR),按照析因設計的實驗要求對不同反應器施加不同干預,觀察氨氮降解,亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成,總混合液懸浮固體(Mixed liquor suspended solids,MLSS)及出水SS(Suspended solids)的變化情況,并通過分子生物學方法研究RP4質粒對AOB的影響機制。實驗共構建了4個SBR,其中水力停留時間(Hydraulic retention time,HRT)為7.2小時。經過馴化調整后,SBR繼續(xù)平穩(wěn)運行約150天。正常運行過程中,氨氮在運行周期90 min內基本去除完全,亞硝酸鹽氮在120 min時基本氧化完成,反應周期末硝酸鹽氮增加量等于初始的氨氮含量。四個SBR平均總MLSS約1235±55.146 mg/L,平均出水SS約為24.95±0.91 mg/m L,SV30約為24%。實驗同時分離純化了一株AOB,經測序鑒定為Nitrosomonas europaea。對4個SBR施加的干預為:A反應器投加不攜帶質粒的大腸桿菌;B反應器投加攜帶RP4質粒的大腸桿菌;C反應器投加RP4質粒;D反應器作為空白對照。干預前持續(xù)記錄7天數據;干預過程持續(xù)7天;干預結束后持續(xù)觀察14天,全程共計28天。觀察的指標有氨氮降解,亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮生成情況,總MLSS及出水SS的變化情況。實驗過程中同時提取污泥樣本,進行總DNA、總RNA的提取和RNA反轉錄的操作;并在SBR運行的第5個周期末對前一天投加供體菌進行計數。研究結果表明,僅投加攜帶RP4質粒的供體菌的B反應器出現了具有統(tǒng)計學意義的變化(P0.05)。且該反應器投加供體菌后氨氮去除率即明顯降低(P0.05),停止投菌后未恢復。在實驗第21天,氨氮去除率降低至70%,然后開始恢復,第25天上升至99%以上。由此可知RP4質粒的存在降低了反應器的氨氧化效率,且影響可持續(xù)一定時間。針對B反應器,亞硝酸鹽氮的生成速率在第20天出現了降低,峰值濃度由約3.0mg/L降低至約1.7mg/L。同時硝酸鹽氮生成減少,第20天時硝酸鹽氮終濃度由約42mg/L降低至40mg/L,但單位時間內生成速率并無明顯變化�？梢奟P4質粒的存在未影響反應器的亞硝酸鹽氧化效率,亞硝酸鹽氮并未出現累積。現已知的亞硝酸鹽氮清除時間延長和周期末硝酸鹽氮濃度降低更有可能是由于氨氧化受抑制而導致的。B反應器的出水SS出現了上升的趨勢(P0.05),且出水SS最高值約達35mg/L。至第14天停止投菌后出水SS仍未恢復。直至后期第21天左右時,出水SS逐漸恢復。此后的出水SS平均水平降低至25mg/L水平�？侻LSS至第28天實驗結束后降低至約800 mg/L(P0.05)。研究發(fā)現投加攜帶RP4質粒的供體菌對SBR造成影響是由于RP4質粒與AOB接合轉移造成的,單純的供體菌和游離的RP4質粒并不能產生較大影響。研究進一步通過所獲得的DNA,cDNA,結合供體菌數量變化,研究RP4質粒對AOB的影響,并對其機制進行分析。變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)結合條帶測序顯示反應器運行初始階段AOB主要為Nitrosomonas和βproteobacterium菌屬,均為不可培養(yǎng)細菌。整個實驗階段主要優(yōu)勢菌群并未發(fā)生明顯變化;H指數在投菌前后也未發(fā)生明顯改變(P0.05)。說明RP4質粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結構改變造成的。持續(xù)投加供體菌時,供體菌數量穩(wěn)定在105 cfu/mL。停止投菌后供體菌數量進行性下降,截止第28天,出水中仍能檢測到102 cfu/mL的供體菌。熒光定量PCR測定AOB,RP4質粒和總細菌的數量變化。結果顯示,在投加供體菌之前,AOB與總細菌的比值約為10-4。投加供體菌的過程中,AOB與細菌的比值依舊保持穩(wěn)定。投加供體菌結束后,從第20天開始,AOB與總細菌的比值出現了一定升高(P0.05)。在投加供體菌之前,RP4質粒與總細菌的比值約為10-7。投加供體菌之后,比值迅速升高,達到10-2,并在投菌過程中基本維持在這一水平。投加供體菌結束之后,RP4與總細菌的比值出現一定的下降,但程度并不明顯,至第28天時比值仍大于10-5,提示了RP4質粒與AOB等反應器內原有的微生物之間發(fā)生了接合轉移。通過AOB探針、RP4探針和總細菌核酸染料DAPI進行的熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)提示了氨氧化菌和RP4質粒的共定位關系,即質粒位于氨氧化菌細胞內。說明了RP4質粒在活性污泥中發(fā)生了水平轉移。同時純培養(yǎng)AOB,不攜帶RP4質粒的大腸桿菌和未投加供體菌的活性污泥的三個對照組中并沒發(fā)現熒光共定位的現象。這表明RP4質粒與包括AOB在內的污泥中微生物的接合轉移,即異養(yǎng)菌(供體菌)向自養(yǎng)菌(受體菌)的接合轉移,是可以在SBR正常運行過程中實現的。由cDNA通過熒光定量PCR得到的amoA基因和hao基因表達情況的數據繪制成熱圖(heatmap),發(fā)現僅投加攜帶RP4質粒的供體菌的B反應器中AOB的amoA基因和hao基因的轉錄有所增加。停止投菌(第14天)后,轉錄依然處于較高水平。至第28天時,amoA基因和hao基因的轉錄未明顯下調。RP4質粒在AOB中發(fā)生接合轉移進而上調amoA基因和hao基因的轉錄,這有可能是AMO等相關酶數量或(和)功能不足導致的反饋調節(jié)。綜合以上結果:(1)構建了平行運行硝化反應器系統(tǒng)(SBR),并分離純化出一株AOB,經鑒定為Nitrosomonas europaea。(2)研究證實了在SBR系統(tǒng)中,RP4質粒的水平轉移可通過供體菌(異養(yǎng)菌)與包括AOB(自養(yǎng)菌)在內的活性污泥微生物發(fā)生接合轉移而實現。(3)攜帶RP4質粒的供體菌與AOB的接合轉移,是造成SBR硝化效率下降,污泥形狀改變(增加出水SS)的主要原因。單純的供體菌和RP4質粒并不能產生較大影響。(4)構建的SBR中AOB的優(yōu)勢菌群是Nitrosomonas和βproteobacterium。在發(fā)生RP4質粒的接合轉移之后,菌群結構并未發(fā)生明顯改變。說明RP4質粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群結構改變造成的。(5)RP4質粒在AOB中發(fā)生的接合轉移可以上調amoA基因和hao基因的轉錄。這有可能是RP4質粒導致的AMO等相關酶數量或(和)功能不足的一種反饋調節(jié)。
[Abstract]:In this paper , we studied the effect mechanism of RP4 plasmid and AOB on the environment and human health , and the effect mechanism of RP4 plasmid on AOB was studied . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the nitrogen removal efficiency of the reactor was reduced to about 1 . 7 mg / L . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria was about 10 - 4 . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the donor bacterium was added . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the addition of donor bacteria . ( 4 ) The dominant flora of AOB in SBR was Nitrosomonas and 尾 proteinate . After the transfer of RP4 plasmid , the structure of bacteria did not change significantly . The decrease of ammonia oxidation efficiency caused by RP4 plasmid was not caused by the change of the structure of the bacteria .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X172;X703

【參考文獻】

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1 楚江;王一農;章文軍;張德民;;亞硝化單胞菌(Nitrosomonas sp.)THD-1分離鑒定及高密度培養(yǎng)[J];生物學雜志;2012年05期

2 陳亞平;葉宏;王娟;;亞硝化單胞菌的分離鑒定及其降解特性的研究[J];環(huán)境科學與技術;2007年09期

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1 張斌;MBR和GSBR中微生物群落生態(tài)學研究[D];天津大學;2010年

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1 鄒文慈;耐藥質粒RP4在不同微生物聚集體中水平轉移規(guī)律及其對氨氧化的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2016年

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本文編號：1526103