發(fā)布時間：2017-11-05 17:27

  本文關(guān)鍵詞：銅離子對小鼠原代肝細(xì)胞及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的毒性效應(yīng)的研究

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【摘要】：銅是生物體必需的微量元素之一,對生命活動具有舉足輕重的作用。然而,銅作為一種重金屬,在能源、電鍍、建筑、交通運(yùn)輸、軍事武器等行業(yè)的應(yīng)用十分廣泛,銅對環(huán)境造成的污染問題也越來越嚴(yán)重,其對健康的危害也越來越突出。重金屬銅可通過消化道、呼吸道和皮膚等吸收進(jìn)入體內(nèi),經(jīng)血液循環(huán)輸送到各個器官,并在肝臟、腎臟、大腦等器官處積累,造成細(xì)胞、器官以及機(jī)體的氧化損傷。眾多疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激效應(yīng)密切相關(guān)。研究表明,銅類污染物可誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激,使機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧,打破機(jī)體正常的氧化還原平衡,造成生物大分子、脂類物質(zhì)、DNA的氧化損傷,進(jìn)而引起細(xì)胞氧化損傷或功能紊亂,誘發(fā)疾病等。重金屬類污染物的毒性效應(yīng)往往體現(xiàn)在分子、細(xì)胞和動物三個層面上,單一層面的評價不足以全面闡明銅的毒性效應(yīng)。因此,有必要從多個層次探究銅離子暴露誘發(fā)的氧化損傷毒性機(jī)理和揭示銅暴露健康損害的微觀機(jī)制。本文從銅毒性作用與氧化應(yīng)激效應(yīng)的相關(guān)性入手,以細(xì)胞毒理學(xué)和分子毒理學(xué)為依托,從細(xì)胞和分子水平上評價銅暴露誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷的毒性效應(yīng)、機(jī)理以及銅與蛋白質(zhì)作用機(jī)理。本文包括以下五個部分：第一部分：介紹了銅污染誘發(fā)的毒性作用、氧化應(yīng)激效應(yīng)以及銅誘發(fā)的毒性效應(yīng)與氧化應(yīng)激的關(guān)系。介紹了本研究領(lǐng)域的進(jìn)展、存在的問題,論文涉及的主要技術(shù)方法、論文的研究內(nèi)容與意義等。第二部分：選取小鼠原代正常肝細(xì)胞為研究對象,從群體細(xì)胞和單細(xì)胞水平評估短期銅暴露誘發(fā)的氧化損傷效應(yīng)。銅暴露后細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的突出表現(xiàn)就是細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,MDA含量升高、GSH含量下降、氧化應(yīng)激酶SOD活性的升高。同時,由于ROS含量水平的升高和氧化防御機(jī)制的改變,銅暴露誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。此外,群體細(xì)胞平均分析水平上ROS的產(chǎn)生、GSH的消耗以及DNA的損傷程度在較低濃度(10或50μM)變化并不顯著,但是通過單細(xì)胞水平分析發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞內(nèi)的上述指標(biāo)已經(jīng)發(fā)生變化,高ROS水平、低GSH含量以及具有明顯DNA損傷特征的細(xì)胞在低濃度銅染毒組中開始出現(xiàn),說明單細(xì)胞水平上能更靈敏地評價污染物早期的毒性效應(yīng),有利于早期診斷、預(yù)警技術(shù)的建立。第三部分：以氧化應(yīng)激關(guān)鍵酶過氧化氫酶(CAT)為研究對象,從細(xì)胞和分子兩個層面上研究了Cu~(2+)對CAT的結(jié)構(gòu)和功能的影響。研究表明,銅暴露誘發(fā)的氧化應(yīng)激效應(yīng)導(dǎo)致了小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)CAT酶活性的下降；同樣,Cu~(2+)可通過與CAT的結(jié)合作用抑制了離體的CAT酶的活性。分子水平上的研究結(jié)果表明Cu~(2+)可引起CAT熒光猝滅,導(dǎo)致其骨架結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的改變。兩者可能的結(jié)合位置位于活性中心的p-折疊附近,Cu~(2+)與His74(組氨酸)和Ser113(絲氨酸)發(fā)生相互作用。過氧化氫酶二級結(jié)構(gòu)的改變和銅離子與His74氨基酸的結(jié)合是酶活性發(fā)生顯著下降的主要原因。第四部分：以氧化應(yīng)激相關(guān)酶溶菌酶(Lysozyme)為研究對象,利用多種光譜學(xué)手段、等溫滴定量熱技術(shù)ITC及分子模擬、酶活性測試等方法研究了Cu~(2+)與溶菌酶的相互作用機(jī)理。研究表明,Cu2+與溶菌酶結(jié)合反應(yīng)是一個自發(fā)地過程,其主要作用力是疏水作用力,298 K時大約有3個結(jié)合位點。一定濃度的銅離子會致使溶菌酶發(fā)生熒光靜態(tài)猝滅,改變了色氨酸殘基的微環(huán)境,使得溶菌酶蛋白質(zhì)骨架變得疏松、二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。而且基于活性殘基谷氨酸(Glu 35)和(天冬氨酸)Asp 52位于銅與溶菌酶的結(jié)合部位,銅暴露影響了溶菌酶活性的表達(dá)。第五部分：以生物大分子人血清白蛋白(HSA)為研究對象,分子水平上研究了銅離子對HSA結(jié)構(gòu)和功能的影響以及兩者相互作用的機(jī)理。研究表明,銅離子主要以動態(tài)猝滅形式引起人血清白蛋白內(nèi)源熒光猝滅,銅離子達(dá)到一定濃度后,進(jìn)而會導(dǎo)致其骨架結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；銅離子自發(fā)地與人血清白蛋白通過疏水作用力結(jié)合,結(jié)合位點數(shù)大約為1。人血清白蛋白酯酶活性在銅離子濃度達(dá)到8×10-5M時受到明顯抑制,進(jìn)而可能影響其功能。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X171.5

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本文編號：1145202