【摘要】：酪蛋白磷酸肽(CPPs)是具有結(jié)合礦物質(zhì)作用的活性肽,人們對(duì)它的研究開發(fā)較早,已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),但是伴隨其生產(chǎn)產(chǎn)生的副產(chǎn)物CNPPs未得到足夠的重視和研究開發(fā)。由于CNPPs中的疏水性氨基酸含量較高,是ACE抑制肽的良好來源,特別是肽段相對(duì)分子質(zhì)量小、含有特定疏水性氨基酸時(shí)具有較高的ACE抑制活性,因此本研究采用酶膜耦合法處理CNPPs制備ACE抑制肽,通過對(duì)CNPPs的控制水解,制備和分離相對(duì)分子質(zhì)量較小的酶解產(chǎn)物,循環(huán)利用水解酶,建立一種制備ACE抑制肽的新方法。 首先,對(duì)CNPPs的氨基酸組成和相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,CNPPs疏水性氨基酸的摩爾百分比和疏水性值分別為54.67%和7.47,相對(duì)分子質(zhì)量大于1500Da的肽占相當(dāng)大一部分比例。CNPPs經(jīng)1K膜超濾分離后,相對(duì)分子質(zhì)量小于1K Da濾過液的ACE抑制率為50.40%,遠(yuǎn)高于相對(duì)分子質(zhì)量大于1K Da的肽的ACE抑制率18.82%。結(jié)合CNPPs和ACE抑制肽的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn),有對(duì)CNPPs進(jìn)一步研究的必要。 然后,對(duì)CNPPs酶膜耦合法制備ACE抑制肽水解用酶進(jìn)行篩選。對(duì)幾種蛋白酶制備的ACE抑制肽的抑制活性、得率和酶活力保留率的測(cè)定結(jié)果表明,Protease N制備ACE抑制肽的抑制率大于55%,酶活力保留率大于90%,優(yōu)于其它幾種蛋白酶。ACE抑制肽得率較高,僅次于AS1398中性蛋白酶。綜合考慮,Protease N是適合酶膜耦合法制備ACE抑制肽的水解用酶。 接著研究了CNPPs酶膜耦合反應(yīng)的條件。以ACE抑制肽得率和酶殘余活力為指標(biāo),確定了各反應(yīng)條件對(duì)CNPPs酶膜耦合反應(yīng)影響的主次順序?yàn)?壓力進(jìn)料速度溫度加酶量。最后得出CNPPs酶膜耦合反應(yīng)較佳條件為:壓力12psi,進(jìn)料速度145mL/min,溫度47.5℃,加酶量6000 U/g蛋白質(zhì)。在此優(yōu)化條件下對(duì)CNPPs酶膜耦合反應(yīng),達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)后,濾液肽濃度為2.5mg/mL,膜通量為50mL·min~(-1)·m~(-2),反應(yīng)器中肽濃度為5.7 mg/mL,蛋白酶活力每小時(shí)下降8%左右。 最后對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行脫鹽并對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。大量無機(jī)鹽的存在使ACE抑制肽的品質(zhì)受到影響,本文選擇DA201-C大孔吸附樹脂可以完全脫除ACE抑制肽中的鹽分。用85%(v/v)乙醇靜態(tài)解吸,蛋白質(zhì)回收率大于85%,所得ACE抑制肽脫鹽率大于95%。IC50值由脫鹽前0.86mg/mL降到脫鹽后0.12mg/mL。經(jīng)體外消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽具有穩(wěn)定性。
【圖文】：

馬尿酸的生成量可以通過 RP-HPLC 圖譜定量測(cè)定，如圖 2-1 所示，馬尿酸的洗脫峰峰面積與馬尿酸的濃度成很好的線性關(guān)系。圖2-2 馬尿酸的RP-HPLC圖譜Fig.2-2 Chromatograms of Hippuric acid on RP-HPLC由馬尿酸的 RP-HPLC 圖 2-2 可知，，馬尿酸與其他物質(zhì)可以完全分開，則用 RP-HPLC法可以準(zhǔn)確測(cè)定馬尿酸的量。2.4 結(jié)果與討論2.4.1 CNPPs 的氨基酸組成及疏水性值CNPPs 的氨基酸組成和疏水性值見表 2-1。CNPPs 疏水性氨基酸的摩爾百分比和疏水性值分別為 54.67%和 7.47。CNPPs 中疏水性氨基酸比例較高，這說明制備的 CNPPs具有較強(qiáng)的疏水性。測(cè)定結(jié)果符合預(yù)期的判定，酪蛋白中的疏水性氨基酸主要集中在酪

有時(shí)洗脫體積會(huì)大于“床體積”。嚴(yán)格來說，這種現(xiàn)象是不般原理，如有些芳香族物質(zhì)、雜環(huán)類化合物、酚類物質(zhì)等的洗脫體積體積”，這種情況對(duì)于凝膠層析機(jī)理的解釋會(huì)造成一些偏差，然而并不[67]。具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、條件溫和、重復(fù)性好和樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)Ps 的相對(duì)分子質(zhì)量分布的情況，我們采用凝膠過濾色譜對(duì)其進(jìn)行分離分離的混合肽中相對(duì)分子質(zhì)量小于 1500Da 的組分占很大比例，因而 1500Da 的 Sephadex G-15 對(duì)其進(jìn)行分離。 Sephadex G-15 對(duì) CNPPs 的分離圖譜，由圖譜及凝膠色譜原理可知，1/2 柱體積（即相對(duì)分子量大于 1500Da）的洗脫峰面積大于洗脫體積即相對(duì)分子質(zhì)量大于 1500Da）的洗脫峰面積，所以 CNPPs 中相對(duì)分Da 的肽所占比例較相對(duì)分子量大于 1500Da 肽的比例略大。由于相對(duì)ACE 抑制肽的活性有影響，CNPPs 中相對(duì)分子質(zhì)量較大的肽也占有相，所以有對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究必要。.4
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：TQ464.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2577980