本文選題：透明質(zhì)酸　切入點：測定方法　出處：《江南大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡稱HA)是一種重要的醫(yī)藥材料和化妝品原料,并被列為新資源食品。近年來,微生物發(fā)酵法已經(jīng)逐步取代了動物組織提取法,成為制備HA的主要方法。 在發(fā)酵法制備HA的過程中,需要對大量發(fā)酵液樣品進行HA含量的測定。傳統(tǒng)的Bitter-Miur法測定步驟繁瑣,以濃硫酸-咔唑溶液為反應試劑,具有一定危險性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,簡稱CTAB)與HA反應產(chǎn)生混濁的特性,建立了CTAB比濁法:配制25 mg/ml的CTAB試液,選擇400 nm作為CTAB比濁法的吸收波長,在室溫下,將純化后的樣液與CTAB試液準確反應10 min,各樣品的測定時間誤差控制在10 s以內(nèi),通過標準曲線測算出待測樣中HA含量。試驗表明,CTAB比濁法的準確度、精確度和靈敏度均高于Bitter-Muir法。除了蛋白質(zhì)外,其它雜質(zhì)對CTAB比濁法影響較小。該法安全性高,操作簡便快捷,適合對大量發(fā)酵液樣品進行測定,適用于測定HA的分子量范圍為≥50 000 Da。 本研究以馬疫鏈球菌(Streptococcus equisimilis)為出發(fā)菌,通過紫外線和60CO-γ射線輻照相結(jié)合的方法對出發(fā)菌株進行誘變選育,篩選出無溶血性、HA產(chǎn)量和分子量均較高的突變株NC168,其HA產(chǎn)量為150.61 mg/L,分子量為677 000 Da。突變株經(jīng)過多次傳代,HA產(chǎn)量和HA分子量保持穩(wěn)定,溶血性無回復突變現(xiàn)象,為進一步研究發(fā)酵法生產(chǎn)HA打下了基礎(chǔ)。針對突變株NC168,通過單因素試驗和二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,并建立了回歸模型: Y=174.76168+6.09122X3-9.26943X12-12.92694X22-14.36237X32-12.20569X42由此得到了最佳培養(yǎng)基:酵母膏30 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖5 g/L和MgSO4·7H2O 1.5 g/L,模型預測HA產(chǎn)量為174.76 mg/L,驗證試驗HA產(chǎn)量達到178.53 mg/L,模型能較好的預測HA產(chǎn)量。將此培養(yǎng)基應用于5 L發(fā)酵罐,進行分批發(fā)酵試驗。研究表明:pH值,初糖濃度,溫度和攪拌速度對HA產(chǎn)量均有顯著影響。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:pH值為7.0,初糖濃度為30 g/L,溫度35℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵HA的產(chǎn)量可達3.0 g/L。在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上,以Logistic,Slogistic和SGompertz三種模型對菌體生長過程中生物量和HA產(chǎn)量進行非線性擬合,結(jié)果表明,生物量模型以Logistic模型擬合效果最佳,擬合方程為: y = 2 .933?1 +(x/21.18.41985)4.453,相關(guān)系數(shù)R2達到0.999;而在HA合成擬合中,以Slogistic模型最佳,擬合方程為:y =(?),相關(guān)系數(shù)R2為0.996;在對基質(zhì)(葡萄糖)的消耗擬合中,采用DoseResp模型,擬合方程為: y =(?),相關(guān)系數(shù)R2為0.991。 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀與超濾相結(jié)合的方法對HA進行分離純化。將發(fā)酵液稀釋到HA含量為0.6-0.8 g/L,加入發(fā)酵液體積15%的CTAB溶液(質(zhì)量分數(shù)為10%),在35℃下沉淀1 h,將沉淀置于濃度為1.5 mol/L的NaCl溶液中解離4 h,選擇濃度為70%乙醇進行沉淀。經(jīng)上述處理后HA得率可達93.8%,HA中蛋白含量可降至1.5%。選擇截留分子量為100 KDa的超濾膜對經(jīng)過季銨鹽沉淀得到的HA進行超濾,樣液濃度為0.02%-0.05%,過膜壓力為11 psi,HA得率可達到93.5%,蛋白去除率達到94.0%。經(jīng)分離純化后,HA總得率為87.7%,HA中蛋白含量可降至0.09%,葡萄糖醛酸含量可達43.5%,達到醫(yī)藥級水平。 為了獲得性能良好的HA水凝膠,選擇分子量為1 500 000 Da的HA與海藻酸鈉(sodium alginate,簡稱SAL)進行復合改性。以醋酸鹽緩沖液作為調(diào)節(jié)pH的試劑,碳化二亞胺(EDC)作為羧基激活劑,已二酰肼(ADH)作為交聯(lián)劑,制備了HA-SAL復合水凝膠。通過紅外光譜驗證了HA與SAL之間形成的酰胺鍵,通過電鏡觀察了所形成凝膠的微結(jié)構(gòu)。質(zhì)構(gòu)特征分析表明,凝膠的硬度隨著兩種多糖濃度升高而增加,隨著HA/SAL摩爾比例升高而減小。凝膠的溶脹率與HA的比例成正相關(guān),而與EDC用量成負相關(guān)。隨著SAL比例和EDC用量的增加,所形成凝膠的抗透明質(zhì)酸酶降解能力得到提高。所制備的HA-SAL水凝膠具有較高的溶脹率、理化穩(wěn)定性、天然的生物相容性和一定的生物降解性,具有應用于真皮填充物、組織工程支架材料等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在用途。
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【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：TQ920.1

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳輝;于剛;高瑞昌;吳燕燕;戚勃;馬海霞;陳勝軍;;水生生物來源透明質(zhì)酸的生化特性及其制備的研究進展[J];食品工業(yè)科技;2013年09期

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1 鄧開野;生物體透明質(zhì)酸的仿生制取[D];吉林大學;2004年

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本文編號：1616584