本文關(guān)鍵詞：CARM1對(duì)胚胎造血以及胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)

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【摘要】：前言 造血干細(xì)胞的自我更新以及全能分化的能力持續(xù)終身。表觀遺傳修飾能夠促進(jìn)細(xì)胞分化。因?yàn)榧?xì)胞分化前后的遺傳信息不同,DNA甲基化和組蛋白甲基化等表觀修飾對(duì)于細(xì)胞分化保持在某一狀態(tài)必不可少。表觀遺傳機(jī)制如同鉸鏈般控制定向分化,但是一般來說對(duì)去分化卻不起這樣的作用。一些小分子表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白,以及一些特殊基因的過表達(dá),可以作為影響細(xì)胞分化的可塑性元件。當(dāng)這些因素被逆轉(zhuǎn),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入iPS (induced pluripotent stem)全能分化狀態(tài)。由此,造血干細(xì)胞的分化過程可能是研究表觀遺傳改變的最好的生物學(xué)系統(tǒng)。近期研究對(duì)DNA的甲基化模式的研究表明在造血過程中每一個(gè)時(shí)期,每個(gè)亞群細(xì)胞定向中存在其特殊的甲基化形式。同DNA甲基化一樣,大量相關(guān)研究表明精氨酸甲基化在淋巴細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用同樣重要。作為一種常見的轉(zhuǎn)錄后修飾,精氨酸的甲基化往往改變其底物的生物學(xué)作用,其機(jī)理如下：1)為含Tudor結(jié)構(gòu)的效應(yīng)因子(effectot molecules)提供了錨docking site[7.8.9.10];2)阻斷蛋白-蛋白相互作用,如某些SH3結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的相互作用；3)對(duì)AKT介導(dǎo)的磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)作用,因?yàn)锳KT序列含有氨基酸殘基；4)阻斷賴氨酸甲基化。 在胞漿和胞核中都有蛋白質(zhì)精氨酸甲基化酶(arginine methyltransfe-rases, PRMTs)的底物存在,組蛋白是胞核中的一種非常重要的底物。PRMTs催化的組蛋白甲基化是轉(zhuǎn)變細(xì)胞命運(yùn)的表觀遺傳密碼的主要成因。哺乳動(dòng)物PRMT酶家族有九個(gè)成員,分別是PRMT1-9。大多數(shù)成員都作用于組蛋白H3的N端,組蛋白4(H4),以及組蛋白2A(H2A)。 CARM1/PRMT4是這個(gè)家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄輔激活因子功能的成員,其作用于H4R17, H3R26,以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。前期研究表明CARM1Knock out小鼠胚胎比野生型小,出生后無法正常呼吸,即刻死亡。對(duì)于該動(dòng)物模型的研究已經(jīng)表明若干表型的存在,大部分與細(xì)胞分化相關(guān)。CARM1Knock out出生致死性與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞過多導(dǎo)致肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞發(fā)育不全有關(guān)。由此,CARM1在正常肺泡細(xì)胞分化中有重要作用。CARM1Knock out小鼠缺乏棕色脂肪,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CARM1null細(xì)胞不能分化成脂細(xì)胞。CARM1在軟骨發(fā)生以及骨骼肌發(fā)育中作用相當(dāng)重要,對(duì)于維持正常胚胎T細(xì)胞數(shù)量及分化有重要作用。綜上,CARM1活性在多個(gè)器官包括肺,脂肪,肌肉,軟骨以及胸腺細(xì)胞中有不可或缺的作用。本課題將進(jìn)一步探索CARM1Knock out小鼠模型的免疫系統(tǒng)表型,CARM1在胸腺細(xì)胞發(fā)育中的作用,及其產(chǎn)生的機(jī)制。 第一部分敲除CARM1基因?qū)π∈罅馨图?xì)胞發(fā)育的影響 目的 觀察敲除CARM1基因?qū)π∈笮叵偌?xì)胞發(fā)育造成的影響。 方法 通過同系繁殖(CARAi+/-小鼠,培育CARM1-/-胚胎；Southern Blot及PCR驗(yàn)證小鼠基因型；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞分析技術(shù),根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物不同,區(qū)分不同亞群,獲得各個(gè)亞群的信息,分析胸腺細(xì)胞。 結(jié)果 驗(yàn)證小鼠體內(nèi)CARM1基因被成功敲除；CARM1基因敲除鼠身長(zhǎng)顯著小于野生型,僅為對(duì)照的60%大��；CARM1基因敲除鼠的胸腺亦顯著小于對(duì)照；CARM1-胸腺細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照；CARM1-/-胸腺中,DN1細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照相近,但DN2,DN3,DN4均減少90%,CD4SP,CD8SP減少75%,y δ T細(xì)胞數(shù)量顯著減少85%。 小結(jié) 驗(yàn)證小鼠體內(nèi)CARM1基因確被敲除；驗(yàn)證胚胎表型,包括胚胎長(zhǎng)度為對(duì)照60%,胸腺發(fā)育不全,存在DN1-DN2發(fā)育阻滯。 第二部分CAR1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷與胸腺上皮細(xì)胞的關(guān)系 目的 鑒于胸腺細(xì)胞發(fā)育與胸腺上皮細(xì)胞(TEC)聯(lián)系密切,探討CARM1-/-小鼠胸腺發(fā)育不全是否有胸腺上皮細(xì)胞中缺乏CARM1引起。 方法 培育CARM1-/-胚胎,免疫熒光化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)E18.5胸腺上皮細(xì)胞各組分的分布；構(gòu)建腎包膜下同種異體胸腺移植模型,分別將去除胸腺細(xì)胞的胸腺上皮組織,植入先天性無胸腺卻有來自骨髓的正常胸腺前T細(xì)胞的受體裸鼠體內(nèi),6-8周后處死小鼠,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胸腺細(xì)胞各個(gè)組分是否重建。 結(jié)果 免疫應(yīng)光化學(xué)顯示：E12.5,E13.5胸腺K5/K8染色中,CARM1-/-胸腺明顯小于同齡對(duì)照,但其皮質(zhì)髓質(zhì)分布形式未見異常；E18.5流式細(xì)胞術(shù)顯示CARM1-/-胸腺其內(nèi)皮質(zhì)細(xì)胞(MHCII+Ly51+)及髓質(zhì)細(xì)胞(MHCII+UEA+)的絕對(duì)數(shù)量與對(duì)照接近,未見異常；及成功構(gòu)建腎下囊同種異體胸腺移植模型后胸腺細(xì)胞得以重建,雖然CARM1-/-數(shù)量較對(duì)照稍少,但其比例未見異常。 小結(jié) 雖然CARM1-/--胸腺小于對(duì)照,但是其皮髓質(zhì)分布正常；據(jù)流式細(xì)胞術(shù),其皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量未見減少；腎下囊同種異體胸腺移植動(dòng)物模型的建立后相關(guān)分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細(xì)胞能夠支持正常前T細(xì)胞的發(fā)育,因此CARM1-/-小鼠的胸腺上皮細(xì)胞數(shù)量及功能未見異常,即CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細(xì)胞引起。 第三部分CARM1造血過程中的影響 目的 觀察CARM1基因敲除后對(duì)小鼠胚胎造血過程的影響,追溯其胸腺細(xì)胞數(shù)目減少最早發(fā)生時(shí)間,探討CARM1-/-胸腺發(fā)育細(xì)胞發(fā)育阻滯,數(shù)量減少的原因,是否由其上游干細(xì)胞的缺陷引起。 方法 培育CARM1-/-還胎,免疫熒光化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同胎齡CARMl-/-胸腺中早期造血祖細(xì)胞的數(shù)量；競(jìng)爭(zhēng)性重建實(shí)驗(yàn)：Actin-GFP小鼠與CARM1+/-雜交獲得GFP+CARMl+/小鼠后,同系繁殖獲得GFP+CARM-/-胚胎,混合相同數(shù)量的GFP+CARMl-/-與GFP-CARMl+/-胸腺細(xì)胞,眼眶后靜脈注射至受體鼠,6-8周后處死受體小鼠,流式細(xì)胞術(shù)分析其胸腺,外周淋巴細(xì)胞各組分是否有效重建。 結(jié)果 1.CARM1-/-E12.5CD45+造血祖細(xì)胞數(shù)目顯著減少,cKit+CD25+染色,顯示早期胸腺細(xì)胞減少改變延續(xù)E13.5乃至E17.5,持續(xù)整個(gè)胚胎期； 2. CARM1-/-骨髓細(xì)胞總數(shù)顯著減少,KLS亞群的比例和絕對(duì)細(xì)胞數(shù)顯著減少；F1k2+MPP減少了95%,LT-HSC和ST-HSC分別減少大約80%；下游的定向分化祖細(xì)胞也受波及,1ineage1℃D27+Flk2+亞群亞群數(shù)量減少93％.CD27+F1k2+亞群減少85%, CMP和MEP明顯減少分別達(dá)92%和66%,GMP未受影響； 3.與骨髓相反,E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)與對(duì)照接近,無顯著差異；CARM1-/-LT-HSC的數(shù)量略為升高,進(jìn)而總KLS細(xì)胞量略高。其他所有造血祖細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異。 4. E14.5GFP+CARM1-/-胚胎肝臟細(xì)胞整體細(xì)胞數(shù)目未見顯著減少,且KLS亞群的比例及比例及絕對(duì)數(shù)量未見差異； 5.競(jìng)爭(zhēng)性重建實(shí)驗(yàn)表明,與Calm+/+干細(xì)胞相比,Carml-/-重建的DN1至CD4SP或CD8SP各個(gè)亞群均大幅度減少。在同樣的競(jìng)爭(zhēng)條件下,Carml-/-干細(xì)胞分化產(chǎn)生的各亞群細(xì)胞,MEP除外,遠(yuǎn)少于Carm1+/+干細(xì)胞。 小結(jié) CARM1-/-骨髓細(xì)胞LT-HSC及其引起的CLP減少,印證E18.5CARM1-/-觀察到的胸腺細(xì)胞和脾B細(xì)胞的減少。由此,CARM1對(duì)于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺,但是未受影響的GMP亞群反應(yīng)CARM1缺失并不影響遲些的髓系分化。E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)未見異常,LT-HSC及KLS細(xì)胞量略高,其他造血祖細(xì)胞數(shù)量未見差異,提示CARM1對(duì)于維持胚胎肝臟中造血祖細(xì)胞的數(shù)量并非必要。競(jìng)爭(zhēng)性重建實(shí)驗(yàn)反映Carm1-/-干細(xì)胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細(xì)胞。雖然在E14.5CARM1-/-胚胎肝臟中存在與對(duì)照無顯著差異數(shù)量的造血干細(xì)胞,但其造血能力因CARM1基因敲除嚴(yán)重受損。鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內(nèi)微環(huán)境CARM1并未敲除,造血干細(xì)胞中內(nèi)源性CARM1在造血過程中必不可少。 結(jié)論 1.驗(yàn)證小鼠體內(nèi)CARM1基因確被敲除；驗(yàn)證胚胎表型包括胚胎長(zhǎng)度為對(duì)照60%,胸腺發(fā)育不全,存在DN1-DN2發(fā)育阻滯. 2. CARMl-/-胸腺皮髓質(zhì)分布正常；絕對(duì)數(shù)量未見減少；腎下囊同種異體胸腺移植動(dòng)物模型的建立后相關(guān)分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細(xì)胞能夠支持正常前T細(xì)胞的發(fā)育,CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細(xì)胞引起。 3.CARM1-/-骨髓細(xì)胞LT-HSC及其引起的CLP減少,與E18.5CARM1-/-觀察到的胸腺細(xì)胞和脾B細(xì)胞的減少呼應(yīng)。CARM1對(duì)于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺,但是未受影響的GMP亞群反應(yīng)CARM1缺失并不影響髓系分化。 4.E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)未見異常,LT-HSCs及KLS細(xì)胞量略高,其他造血祖細(xì)胞數(shù)量未見差異,提示CARM1對(duì)于維持胚胎肝臟中造血祖細(xì)胞的數(shù)量并非必要。 5.競(jìng)爭(zhēng)性重建實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映同等條件下,Carm1-/-干細(xì)胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細(xì)胞,E14.5CARM1-/-胚胎肝臟造血干細(xì)胞的造血能力因CARM1基因敲除嚴(yán)重受損。 6.鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內(nèi)微環(huán)境CARM1并未敲除,造血干細(xì)胞中內(nèi)源性CARM1在造血過程中必不可少。
【關(guān)鍵詞】：CARM1 胸腺細(xì)胞 胸腺上皮細(xì)胞(TEC) 造血干細(xì)胞(HSC) 腎下囊同種異體移植 競(jìng)爭(zhēng)性重建實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：D919.1
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-15
• 英文縮略語(yǔ)注釋15-16
• 前言16-19
• 第一部分 敲除CARM1基因?qū)π∈罅馨图?xì)胞發(fā)育的影響19-36
• 前言19-22
• 材料與方法22-30
• 結(jié)果30-35
• 小結(jié)35-36
• 第二部分 CARM1~(-/-)小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷與胸腺上皮細(xì)胞的關(guān)系36-53
• 前言36-39
• 材料與方法39-47
• 結(jié)果47-52
• 小結(jié)52-53
• 第三部分 CARM1在造血過程中的影響53-73
• 前言53-56
• 材料與方法56-65
• 結(jié)果65-72
• 小結(jié)72-73
• 討論73-75
• 結(jié)論75-76
• 參考文獻(xiàn)76-86
• 附錄86-87
• 致謝87-88

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Thymic epithelial progenitor cells and thymus regeneration: an update[J];Cell Research;2007年01期

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本文編號(hào)：593798