本文關鍵詞：束縛應激加重擠壓傷大鼠心臟損害及其內質網應激機制

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【摘要】：目的：在法醫(yī)學實踐中，非致命機械性損傷后發(fā)生心衰，甚至死亡的案件與日劇增。此類案件多見于爭執(zhí)、打架、刑訊逼供、虐待等，也可見于交通事故和礦難等意外事故。此類損傷本身不足以導致當事人死亡，而且死者生前往往沒有明顯的心血管疾病，因此常常由于死亡原因不能確定或有爭議，導致案件久拖不決，給社會造成不良影響。此外，在臨床實踐中也經常發(fā)生非致命傷患者在治療期間病情逐漸加重甚至突發(fā)心衰的情況，致使醫(yī)務人員難以應對。因此研究非致命性機械性損傷導致心衰甚至死亡的機制是法醫(yī)學亟待解決的問題。 損傷對機體的影響除了局部組織損傷，或進一步引發(fā)全身炎癥反應和遠隔器官損傷以外還可以引起機體的應激反應，其中損傷本身屬于軀體應激原；此外，當事人在遭受損傷后由于各種原因往往會產生焦慮、緊張或抑郁等不良情緒，這些負性情緒屬于心理應激原[1]。應激時下丘腦垂體腎上腺皮質軸（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA軸）和藍斑交感腎上腺髓質系統(tǒng)（locus cereus norepinephrine axis, LC/NE軸）激活，血液及尿液中兒茶酚胺和糖皮質激素水平升高[2]。適度應激對于機體抗損傷具有重要的防御意義，但過度強烈的應激可引起組織器官損傷。而應激是否參與非致命性機械性損傷導致心衰的過程，尚不清楚。 應激原作用于機體后，除了引起整體水平的應激反應外，還可以導致細胞水平的應激，使細胞出現一系列適應性代償反應。細胞水平的應激主要包括熱休克反應（heat shock response, HSR）和內質網應激（endoplasmicreticulum stress, ERS)兩種。而近些年，內質網應激越來越受到研究人員的廣泛重視，國內外也有相關文獻指出，心臟的多種疾病的發(fā)生都與內質網應激有關。真核細胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在內質網中合成后，經過翻譯后修飾，折疊和組裝，由高爾基體進一步加工后轉運到膜上或分泌到細胞外。當受到各種應激原刺激時，新生肽鏈的修飾折疊與組裝受到干擾，將引起未折疊蛋白在ER中堆積，使細胞發(fā)生ERS，并激活未折疊蛋白反應信號傳導通路（unfolded protein response, UPR），幫助錯誤折疊蛋白恢復正常折疊，以提高細胞在有害因素下的生存能力。其中葡萄糖調節(jié)蛋白（glucose-regulated protein, GRP78）表達增加是UPR通路激活的標志蛋白[4]。但是當細胞自身處理能力不及應激原強度時，內質網一方面會啟動其特有的凋亡信號，以C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)表達增多為標志；另一方面還可激活炎癥信號通路。越來越多的證據表明UPR的信號通路與炎性反應通路之間是通過不同的機制是相互聯系的[19]。因此，強烈的應激原可通過誘導ERS引起細胞凋亡和炎癥反應，造成組織損傷。有文獻報道，ERS參與多種心血管疾病的發(fā)生[4-6]。而ERS是否參與非致命性機械性損傷導致心肌損傷的過程尚不清楚。 為了模擬損傷和應激共同參與的實際案件，本實驗將采用擠壓傷與束縛應激的復合模型，觀察束縛應激對擠壓傷大鼠心臟損傷的影響，并進一步探討內質網應激在其中的作用。 方法： 1.分組: Sprague Dawley(SD)大鼠36只，雄性，體重200g-220g，適應性喂養(yǎng)7天后，，隨機分組，每組6只。正常組，對照組，束縛應激組，擠壓組，應激后擠壓組，應激加擠壓加內質網應激抑制劑組。①正常組：24小時正常喂養(yǎng)，每天與其他組造模前后分別稱重；②禁食水組：每天在束縛應激組8小時內禁食水，其余時間自由飲食活動，連續(xù)7天，并分別在造模前后稱取大鼠體重；③束縛應激組：實驗時每天在相同時間將大鼠置于固定器中限制其活動8小時，其余時間大鼠自由飲食活動，連續(xù)束縛應激7天。實驗開始及造模結束時分別稱重；④擠壓組：實驗時乙醚麻醉后，把大鼠俯臥位固定于鼠臺上，于雙后肢上壓24kg重物，連續(xù)擠壓6h，然后去除重物、釋放大鼠，任其自由飲食、活動；⑤復合模型組：在連續(xù)7天束縛應激結束后，于次日乙醚麻醉，把大鼠俯臥位固定于鼠臺上，于雙后肢上壓24kg重物，連續(xù)擠壓6h，然后去除重物、釋放大鼠，任其自由飲食、活動；⑥ERS抑制劑組，每天分別在束縛應激之前半小時按10mg/ml腹腔給予內質網應激抑制劑4苯基丁酸（4-Phene butyric,4-PBA）后進行連續(xù)束縛應激7天后擠壓，方法同上。 2.正常組，對照組和束縛應激組分別于造模結束即刻取大鼠心臟組織；擠壓組，復合模型組以及ERS抑制劑組分別于造模結束后5天取大鼠心臟組織固定，脫水透明，浸蠟包埋，做石蠟切片，石蠟切片進行HE染色觀察心肌組織病理學改變及應用免疫組織化學染色方法觀察大鼠心肌組中GRP78、CHOP蛋白的表達變化。 3.留取各個組大鼠心尖組織-80℃凍存，應用Western印跡法檢測大鼠心肌組織GRP78、CHOP、Caspase3蛋白的表達變化及ELISA檢測心肌組織炎癥因子IL-1的表達量改變。 4.用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據用均數±標準差(Mean±SD)表示。各組均數的比較行單因素方差分析（ANOVA），以最小顯著差異法做兩兩比較，以p＜0.05為有顯著差異。 結果： 1心臟HE染色 正常組，禁食水組可見心肌纖維排列整齊，結構清晰，細胞大小一致，。而在束縛應激組心肌間質可見少量炎細胞浸潤。擠壓組心肌間質內炎細胞增多，局部肌纖維細胞嗜伊紅染色加深。但與擠壓傷組相比，復合模型組肌纖組織病理學變化更加嚴重，出現肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維呈波浪樣變。與復合模型組相比，給予ERS抑制劑后心肌病理學改變明顯減輕，表現為間質炎細胞明顯減少，不規(guī)則的病理收縮帶減少，收縮帶周圍的正常組織無波浪樣變。 2心肌內質網應激標志蛋白GRP78表達情況 免疫組化結果：在正常組與禁食水組心肌排列整齊，可見少量陽性表達。束縛應激組、擠壓組、復合模型組胞漿著色逐漸加深，陽性細胞數目有所增加，陽性表達輕度增加。陽性細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學改變，細胞皺縮。而ERS抑制劑組與復合模型組相比陽性細胞明顯減少，陽性表達減弱。Western印跡檢測結果：正常組及禁食水組只有少量GRP78表達，束縛應激組、擠壓組表達逐漸增加，與擠壓組比較，復合模型組GRP78表達明顯增加，而給予ERS抑制劑可顯著抑制GRP78表達，該結果與免疫組化結果一致。 3心肌內質網應激凋亡相關蛋白CHOP以及凋亡執(zhí)行者caspase3的表達情況。 CHOP免疫組化結果：在正常組與禁食水組心肌纖維排列整齊，未見陽性表達。束縛應激組、擠壓組、復合模型組胞漿著色由淺及深，陽性細胞數逐漸增多，陽性表達逐漸增強，陽性細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學改變，細胞皺縮，細胞核碎裂、溶解。與復合模型組相比，給予ERS抑制劑后胞漿著色變淺，陽性表達減弱。CHOP Western印跡檢測結果：正常組及禁食水組幾乎沒有表達，束縛應激組、擠壓組表達逐漸增加與擠壓組相比，復合模型組表達明顯增加，給予ERS抑制劑可顯著抑制CHOP表達，該結果與免疫組化結果一致。caspase3的Western結果與CHOP結果一致。 4心肌白細胞介素IL-1表達水平 正常組和禁食水組IL-1表達量很少；束縛組、擠壓組表達量依次增多，與擠壓組相比，復合模型組IL-1表達量明顯升高；ERS抑制劑組IL-1表達量較復合模型組有所減少。 結論: 本研究首次成功地建立了束縛應激和擠壓傷的復合模型，觀察了大鼠心臟的組織病理學、檢測了ERS標志蛋白的表達以及炎癥因子水平變化得出以下結論： 束縛應激可以加重擠壓傷大鼠心肌組織的損害，其機制與ERS誘導凋亡和炎癥有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：D919.1

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

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10 禮曉明;李學金;張s

本文編號：1262179