【摘要】： 隨著人類社會的發(fā)展，能源短缺、環(huán)境污染問題日益突出，已嚴重威脅人類的生存和發(fā)展。沼氣技術(shù)是解決我國農(nóng)村能源危機和環(huán)境污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。由于傳統(tǒng)研究手段的限制，目前對沼氣發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)缺乏全面、準確的了解，從而阻礙了工程和工藝的改進進程，致使農(nóng)村系統(tǒng)運行效率低和可控性差的問題難以解決�，F(xiàn)代分子生態(tài)學技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的成功應(yīng)用，為突破這一技術(shù)瓶頸提供了新思路。本論文運用基于16S rDNA的克隆文庫分析和DGGE指紋圖譜分析等分子生態(tài)學技術(shù)，對農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)進行了解析。 首先通過對前人活性污泥的提取方法改進，建立了農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥總DNA的有效提取和純化方法，DNA的得率、完整性、質(zhì)量均可滿足分子生態(tài)學研究的需要。 通過對PCR-DGGE條件的優(yōu)化，建立了農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE分析體系：25μ1 PCR反應(yīng)體系中，模板量為1ng；采用Touchdown PCR方式；DGGE膠變性劑濃度范圍35％～56％；上樣量為600ng，150V電泳270min，可較為準確地反映農(nóng)村戶用沼氣池厭氧活性污泥微生物的多樣性和群落組成。 分別構(gòu)建了農(nóng)村戶用沼氣池細菌和古菌的16S rDNA文庫，通過文庫分析，對農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的多樣性進行了探索。結(jié)果表明，農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)微生物種類非常豐富，細菌比古菌表現(xiàn)出更為復(fù)雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數(shù)明顯優(yōu)勢種群。其中的細菌，包括72個種群，大多數(shù)屬于未培養(yǎng)菌，主要分屬于五大類：低G+C革蘭氏陽性菌(Firmicutes)、變形細菌(Protecobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、綠屈撓菌(Chloroflexi)和Genera-incertae-sedis-OP11。其中以低G+C革蘭氏陽性菌為主，包含其2個亞類：梭菌(Clostridia)和芽孢桿菌(Bacilli)，占庫容的54％，其次為擬桿菌占庫容36％；其中的古菌，包括9個種群，都屬于廣古菌(Euryarchaeota)，包括甲烷鬃菌(Methanosaeta)、小甲烷粒菌(Methanocorpusculum)、甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷盤菌(Methanoplanus)、甲烷囊菌(Methanoculleus)等，一分類地位不明確的Uncultured euryarchaeote和Methanocorpusculum parvum為優(yōu)勢種群。 利用PCR-DGGE指紋圖譜分析技術(shù)對農(nóng)村戶用沼氣池中正常池和酸化池的細菌和古菌微生物群落結(jié)構(gòu)分別進行了比較，并進行動態(tài)跟蹤監(jiān)測。結(jié)果顯示：兩種沼氣池中微生物種類都非常豐富，細菌比古菌表現(xiàn)出更為復(fù)雜的微生物多樣性。不同微生物種群的豐度存在明顯差異，有少數(shù)明顯優(yōu)勢種群，這與16S rDNA克隆文庫分析結(jié)論基本一致。正常池與酸化池的細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，酸化池中梭菌(Clostridia)比重高，而擬桿菌(Bacteroidetes)相對較少；而兩種池中古菌的群落結(jié)構(gòu)非常相似。由此初步推斷，影響農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵狀況的可能主要是細菌，而不是古菌；不同時期，正常池和酸化池中細菌和古菌的多樣性都基本穩(wěn)定，但部分種群的豐度隨著溫度的變化有所改變，擬桿菌(Bacteroidetes)豐度的隨發(fā)酵溫度升高增加，而梭菌(Clostridial則相反。 本論文初步解析了農(nóng)村戶用沼氣池發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)，為進一步優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)群落功能提供了科學依據(jù)，為實現(xiàn)我國農(nóng)村沼氣發(fā)酵的高效、可控運行奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：S216.4;S182
【圖文】：

圖1一2穩(wěn)定性同位素探測技術(shù)的技術(shù)路線示意圖sIP技術(shù)可以應(yīng)用于厭氧環(huán)境中互營微生物的研究。o印han等(2001)通過該技在冰冷的缺氧沉積物中檢測到極低的’3c:甲烷自然豐度(同其它含碳化合物相)，這表明這些沉積物中存在一組與Methanosarcinales相關(guān)的可氧化甲烷的古菌，

2.1實驗材料2.1.1厭氧活性污泥樣品來源活性污泥樣品采集于北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術(shù)示范基地(圖2一1)沼氣池，基地采用的是以沼氣為紐帶，目前在中國農(nóng)村大力推廣的“豬一沼一果”生態(tài)家園模式。沼氣池建在果樹塑料大棚中豬圈的下面，沼氣發(fā)酵原料為豬糞。采集厭氧活性污泥樣品4℃厭氧保存，12小時內(nèi)對樣品進行處理。圖2一1北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術(shù)示范基地2.1.2菌株菌株 EscherichiacoliDH5a為中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)所保存。2.1.3培養(yǎng)基液體 LBTryptone10.09， Yeastextract5.09， NaCI10.09，定容至IL

本論文的厭氧污泥樣品采集于北京郊區(qū)某能源生態(tài)技術(shù)示范基地沼氣池。基地在開展本研究之前已運行兩年，基地采用的是目前在我國農(nóng)村大力推廣的“豬一沼一果”生態(tài)模式(圖3一l)。沼氣池建于果樹塑料大棚中豬圈的下面，豬糞作為沼氣發(fā)酵的原料，經(jīng)厭氧發(fā)酵產(chǎn)生沼氣、二氧化碳和沼肥。沼氣發(fā)酵使農(nóng)村重要污染源一畜禽糞便得以充分利用，所產(chǎn)生的沼氣還可以用作生活燃料，二氧化碳可促進果樹的光合作用，同時沼肥是優(yōu)質(zhì)的有機肥。沼氣池是該模式的核心，它聯(lián)結(jié)著養(yǎng)殖和種植，起到了生產(chǎn)和生活的樞紐作用。2006年初，本研究對該村80多戶農(nóng)村戶用沼氣池的運行狀況(發(fā)酵液的酸堿度和產(chǎn)氣量狀況等)進行了初步調(diào)查分析。調(diào)查結(jié)果(表3一l)顯示:發(fā)酵液pH為7.0一7.5、發(fā)酵狀況正常、產(chǎn)氣量較高的沼氣池占42%;pH低于6.7、產(chǎn)氣量低的酸化池占58%。比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵狀況正常的沼氣池液面泡沫較碎、厚、而小(圖3一2)

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本文編號：2803431