參考大豆疫霉的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)體系,針對(duì)荔枝霜疫霉RXLR效應(yīng)蛋白編碼基因Pl Avh133設(shè)計(jì)了20 bp的sgRNA靶向序列,結(jié)合同源替換的方式對(duì)該基因進(jìn)行敲除。利用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,共獲得了58個(gè)具有G418抗性的轉(zhuǎn)化子,通過(guò)PCR和測(cè)序分析證明其中5個(gè)轉(zhuǎn)化子的Pl Avh133基因被敲除,敲除效率約為8.6%。熒光定量PCR分析證實(shí)Pl Avh133敲除突變體中該基因不表達(dá)。本研究結(jié)果為荔枝霜疫霉的基因功能研究提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 供試菌株
    1.2 供試培養(yǎng)基及試劑
    1.3 載體及其構(gòu)建
    1.4 PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        1.4.1 菌絲收集
        1.4.2 原生質(zhì)體制備
        1.4.3 轉(zhuǎn)化
    1.5 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證
        1.5.1 PCR驗(yàn)證
        1.5.2 熒光定量PCR驗(yàn)證
2 結(jié)果與分析
    2.1 荔枝霜疫霉對(duì)遺傳霉素(G418)的敏感性
    2.2 荔枝霜疫霉原生質(zhì)體酶解條件分析
    2.3 Pl Avh133的序列特征
    2.4 sgRNA靶向序列的設(shè)計(jì)
    2.5 CRISPR/Cas9敲除策略
    2.6 基因敲除及結(jié)果驗(yàn)證
3 討論



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