目的:制備熱穩(wěn)定性好、耐RNase攻擊及可全程監(jiān)控操作的核酸檢測新型冠狀病毒陽性質控品。方法:分別擴增MS2噬菌體外殼蛋白CP（含PAC位點）基因以及成熟酶蛋白A基因序列（含核糖體結合位點）,先后插入質粒pET28a多克隆位點不同位置,構建通用重組載體pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三個靶標的特定核酸序列,插入到重組載體pET28a/CP-A中PAC位點的下游,構建包含靶序列的重組載體pET28a/CP-A/S。通過原核表達系統(tǒng)表達目的蛋白,采用硫酸銨和凝膠過濾層析進行純化,利用透射電鏡和動態(tài)光散射對蛋白質進行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通過RT-PCR檢測其殘余核酸和熱穩(wěn)定性。結果:成功構建包含MS2噬菌體外殼蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重組載體,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、誘導14h時以可溶性形式得到高效表達,純化后,得到了大小均一、直徑為23～28nm的病毒樣顆粒,經核酸酶消化后RT-PCR檢測,顆粒溶液中幾乎無核酸殘余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破壞試驗表明該盔甲RNA無菌過濾后可在37℃... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質粒和主要試劑
        1.1.2 引物和探針
    1.2 方法
        1.2.1 重組載體構建
        1.2.2 重組蛋白的表達與純化
        1.2.3病毒樣顆粒的物理表征
        1.2.4 病毒樣顆粒殘余核酸去除
        1.2.6 病毒樣顆粒穩(wěn)定性檢測
2 結果
    2.1 重組載體的構建
    2.2 目的蛋白的表達和純化
    2.3 病毒樣顆粒的物理表征
    2.4 病毒樣顆粒酶消化去除殘余核酸
    2.5 病毒樣顆粒核酸拷貝數確定
    2.6 病毒樣顆粒的熱穩(wěn)定性實驗
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3732016