中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary,CHO）已是應(yīng)用最為廣泛的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)細胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達治療性生物制品的CHO工程細胞系一直是研究工作的熱點。課題組前期組合應(yīng)用慢病毒示蹤報告基因及染色體步移技術(shù),在CHO-K1基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)6個可持續(xù)表達報告基因的位點。本研究對其中一個位點進行了表達穩(wěn)定性的驗證工作,并分別實現(xiàn)了綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）基因和人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）基因在該位點的定點整合和穩(wěn)定表達。一、以整合了Zs Green1報告基因的CHO-K1-ZsGreen1-2C6細胞為研究材料,組合使用倒置熒光顯微鏡和流式細胞術(shù),定量分析了ZsGreen1報告基因的表達情況。按照主細胞庫到2000 L細胞生產(chǎn)罐放大培養(yǎng)的細胞代次需求,連續(xù)傳代培養(yǎng)50代次,發(fā)現(xiàn)100%的CHO-K1-Zs Green1-2C6貼壁和懸浮細胞均可穩(wěn)定表達ZsGreen1報告基因,提示CHO-K1細胞LOC103162981基因NW＿003626341.1內(nèi)第1689堿基（... 

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 工程細胞簡介
        1.1.1 常用的工程細胞
        1.1.2 CHO細胞簡介
    1.2 CHO工程細胞的構(gòu)建
        1.2.1 CHO細胞的表達優(yōu)勢
        1.2.2 CHO工程細胞構(gòu)建的傳統(tǒng)方法
        1.2.3 CHO工程細胞的存在問題
    1.3 CHO工程細胞的研究進展
        1.3.1 抗凋亡工程
        1.3.2 基因位點特異性整合
    1.4 本文研究背景和研究內(nèi)容
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞株和菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要試劑及溶液
        2.1.6 儀器和設(shè)備
        2.1.7 分析軟件
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng)與保藏
        2.2.2 MTT法檢測CHO-K1-ZsGreen1-2C6 貼壁細胞的倍增時間
        2.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1 蛋白表達情況
        2.2.4 流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度
        2.2.5 Zsgreen1 蛋白轉(zhuǎn)錄水平分析
        2.2.6 sgRNA設(shè)計與質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.7 sgRNA可編輯性驗證
        2.2.8 供體質(zhì)粒的設(shè)計與構(gòu)建
        2.2.9 細胞轉(zhuǎn)染和單克隆篩選
        2.2.10 目的基因定點整合的鑒定
        2.2.11 目的蛋白質(zhì)的表達鑒定
        2.2.12 目的蛋白細胞表達水平的檢測
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細胞生長曲線
    3.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細胞表達ZsGreen1 報告基因的穩(wěn)定性評價
        3.2.1 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 貼壁細胞內(nèi)ZsGreen1 基因的表達情況
        3.2.2 CHO-K1-ZsGreen1-2C6 懸浮細胞內(nèi)ZsGreen1 基因的表達情況
        3.2.3 不同代次CHO-K1-ZsGreen1-2C6 細胞內(nèi)ZsGreen1 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測
    3.3 sgRNA質(zhì)粒的驗證及陽性克隆篩選
    3.4 sgRNA編輯效率驗證
    3.5 定點整合基因的鑒定
        3.5.1 定點整合EGFP基因細胞株的鑒定
        3.5.2 定點整合HSA基因細胞株的鑒定
    3.6 目的蛋白表達的鑒定
        3.6.1 EGFP基因表達的鑒定
        3.6.2 HSA基因表達的鑒定
    3.7 EGFP報告基因的表達穩(wěn)定性評價
    3.8 HSA基因表達水平檢測
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中兩種gRNA活性檢測方法比較[J]. 劉燕,任衛(wèi)紅,王綠婭,張曉萍,高詩娟,武威,李鳳娟,杜杰.  心肺血管病雜志. 2016(07)
[2]提高哺乳動物工程細胞抗凋亡能力的基因策略[J]. 徐洪記,張兵兵.  中國生物工程雜志. 2012(06)

博士論文
[1]CHO細胞定點整合穩(wěn)定表達治療性蛋白質(zhì)的研究[D]. 周松濤.江南大學(xué) 2019



本文編號：3727545