Kex2蛋白酶是一種來源于酵母的前體加工蛋白酶,能識(shí)別并切割堿性氨基酸殘基對(duì)中的羧基端肽鍵,在酵母的蛋白分泌途徑中起關(guān)鍵作用,并且在真核細(xì)胞蛋白的研究中也應(yīng)用廣泛。目前多用畢赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）來表達(dá)Kex2蛋白酶,但有關(guān)畢赤酵母Kex2蛋白酶（PPKex2）的同源活性表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)的研究還鮮有報(bào)道,并且Kex2蛋白酶較低的表達(dá)量導(dǎo)致其生產(chǎn)成本過高,不利于大規(guī)模的應(yīng)用。本課題利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PPKex2進(jìn)行了同源表達(dá),并研究其酶學(xué)性質(zhì),同時(shí)與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）Kex2蛋白酶（SCKex2）進(jìn)行了比較。并采用高密度擴(kuò)大發(fā)酵、截短C端序列、更換啟動(dòng)子和伴侶蛋白共表達(dá)等方式提高PPKex2的表達(dá)量。主要研究成果如下所述:（1）分別從畢赤酵母和釀酒酵母基因組中獲得kex2基因,將其插入到表達(dá)載體pPIC9K中,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,結(jié)果表明PPKex2的蛋白濃度達(dá)到0.42 mg·mL^-1,酶活達(dá)到30.2 U·L^... 

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 立題意義
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.2.1 Kex2 蛋白酶簡(jiǎn)介
        1.2.2 Kex2 蛋白酶的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)概述
        1.2.4 實(shí)現(xiàn)畢赤酵母高效表達(dá)的策略
        1.2.5 畢赤酵母啟動(dòng)子研究應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.6 畢赤酵母伴侶蛋白共表達(dá)研究應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.7 畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化策略
    1.3 主要研究思路和研究?jī)?nèi)容
        1.3.1 主要研究思路
        1.3.2 主要研究?jī)?nèi)容
        1.3.3 課題來源
第二章 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基與溶液
        2.1.3 主要試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 P.pastoris GS115 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 PPKex2和SCKex2 表達(dá)質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.3 PPKex2的C端截短表達(dá)質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.4 啟動(dòng)子改造質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.5 共表達(dá)伴侶蛋白質(zhì)粒及表達(dá)菌株的構(gòu)建
        2.2.6 表達(dá)菌株的生長(zhǎng)及目的蛋白的表達(dá)
        2.2.7 Kex2 蛋白酶酶活力測(cè)定方法
        2.2.8 Kex2 蛋白酶的純化與鑒定
        2.2.9 Kex2 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究
        2.2.10 重組菌株3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵和發(fā)酵優(yōu)化
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 PPKex2和SCKex2 的表達(dá)與純化
        3.1.1 畢赤酵母中PPKex2和SCKex2 的表達(dá)
        3.1.2 PPKex2和SCKex2 的分離純化與鑒定
    3.2 PPKex2和SCKex2 的酶學(xué)性質(zhì)比較
        3.2.1 最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度的研究
        3.2.2 pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性的研究
        3.2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
    3.3 PPKex2 重組菌株的高密度發(fā)酵優(yōu)化
        3.3.1 PPKex2的3 L發(fā)酵罐高密度擴(kuò)大發(fā)酵
        3.3.2 添加輔助表達(dá)物對(duì)PPKex2 表達(dá)的影響
    3.4 PPKex2的C端截短(SPPKex2)以提高表達(dá)量的研究
        3.4.1 SPPKex2的C端截短序列的確定
        3.4.2 SPPKex2 在畢赤酵母中的表達(dá)
    3.5 啟動(dòng)子改造對(duì)PPKex2 表達(dá)量的影響
        3.5.1 啟動(dòng)子改造菌株的構(gòu)建與表達(dá)
        3.5.2 雙啟動(dòng)子共表達(dá)菌株的構(gòu)建與表達(dá)
    3.6 伴侶蛋白共表達(dá)對(duì)PPKex2 表達(dá)量的影響
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 ：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]畢赤酵母高效表達(dá)外源蛋白的相關(guān)策略及研究進(jìn)展[J]. 朱文,胡又佳,謝麗萍.  中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志. 2018(04)
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[5]Kex2蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá)、純化和性質(zhì)研究[J]. 劉穎穎,王之可,李素霞.  中國(guó)生化藥物雜志. 2015(01)
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[7]共表達(dá)伴侶蛋白對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶發(fā)酵過程的影響[J]. 盧鑫,喻曉蔚,沙沖,范文來,徐巖.  微生物學(xué)通報(bào). 2013(03)
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碩士論文
[1]酸性脂肪酶的高效表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[D]. 張曉鳳.江南大學(xué) 2018
[2]米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達(dá)、酶學(xué)特性及其應(yīng)用研究[D]. 江婷.江南大學(xué) 2016
[3]分子伴侶與信號(hào)肽對(duì)分泌蛋白在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)水平的影響研究[D]. 杜濟(jì)良.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2011



本文編號(hào)：3705934