微管是真核生物的主要細(xì)胞骨架成分之一,在很多細(xì)胞生物活動中起著重要的作用。微管是一個動態(tài)的結(jié)構(gòu),其動態(tài)性對細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、細(xì)胞極性等生命活動至關(guān)重要。實時監(jiān)測微管的動態(tài)行為有助于理解微管的調(diào)控機(jī)制和微管相關(guān)的細(xì)胞活動過程。但是,關(guān)于微管動態(tài)性調(diào)控的具體分子機(jī)制,尤其是微管蛋白亞型和微管蛋白翻譯后修飾組成的微管密碼對微管動態(tài)性的調(diào)控機(jī)制,仍不甚清楚�；谌珒�(nèi)反射熒光顯微成像的微管體外重構(gòu)是精細(xì)地研究微管自身動態(tài)和微管相關(guān)蛋白對微管動態(tài)性調(diào)控的重要手段。該技術(shù)手段需要在微管蛋白上偶聯(lián)熒光基團(tuán),但是,這一過程步驟繁瑣且導(dǎo)致大部分微管蛋白喪失了微管聚合活性。因此,如何從有限樣本中獲得單一亞型或特定翻譯后修飾的熒光標(biāo)記微管蛋白是微管領(lǐng)域內(nèi)的一大瓶頸,從而限制了利用該技術(shù)手段對微管蛋白密碼的深入研究。目前基于微管藥物的小分子化合物探針對微管動態(tài)性有顯著影響,限制了其在基于全內(nèi)反射顯微成像的微管體外重構(gòu)系統(tǒng)中的應(yīng)用。為了避免對微管動態(tài)性的干擾,我們選擇親和力適中的小肽片段作為微管探針的識別單元。本論文開發(fā)的小肽熒光探針能特異性標(biāo)記微管,可以取代微管蛋白偶聯(lián)熒光基團(tuán)的方法用于體外微管重構(gòu)分析,這使... 

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 微管的結(jié)構(gòu)和功能
        1.1.1 微管的組成和結(jié)構(gòu)
        1.1.2 微管的功能體現(xiàn)
    1.2 微管的動態(tài)不穩(wěn)定性
        1.2.1 動態(tài)是微管的顯著特征
        1.2.2 微管動態(tài)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
        1.2.3 微管動態(tài)調(diào)控
        1.2.4 馬達(dá)蛋白Kinesin-1
    1.3 微管的成像方法
        1.3.1 體外重構(gòu)微管的成像方法
        1.3.2 細(xì)胞內(nèi)微管的成像方法
    1.4 研究目的和研究內(nèi)容
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 研究內(nèi)容
第2章 實驗材料與方法
    2.1 實驗試劑與材料
    2.2 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 噬菌體篩選多肽
        2.3.2 制純化微管蛋白親和柱
        2.3.3 純化微管蛋白
        2.3.4 微管蛋白的熒光標(biāo)記
        2.3.5 微管相關(guān)蛋白的純化
        2.3.6 微管共沉降實驗
        2.3.7 探針標(biāo)記微管的相關(guān)實驗
        2.3.8 基因干擾實驗
        2.3.9 免疫印跡實驗
        2.3.10 免疫熒光實驗
        2.3.11 體外探針孵育活細(xì)胞實驗
        2.3.12 小肽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗
        2.3.13 定量分析方法
第3章 實驗結(jié)果
    3.1 探針設(shè)計與合成
        3.1.1 微管探針的設(shè)計
        3.1.2 探針識別單元的淘選
        3.1.3 探針的合成
    3.2 成功搭建基于全內(nèi)反射熒光顯微鏡的體外微管研究技術(shù)體系
    3.3 探針標(biāo)記體外重構(gòu)的微管
        3.3.1 合成的初步探針不能標(biāo)記微管
        3.3.2 改造后的探針可以標(biāo)記微管
    3.4 分析探針標(biāo)記的特點
        3.4.1 即加即用型的探針結(jié)合在微管外側(cè)的羧基端
        3.4.2 探針標(biāo)記呈劑量依賴的靈敏性
        3.4.3 探針與微管的結(jié)合強(qiáng)度
        3.4.4 探針標(biāo)記具有抗光漂白特性
        3.4.5 探針標(biāo)記的信噪比可得到提高
    3.5 探針可用于研究微管自身的動態(tài)性
        3.5.1 渾濁度實驗證實合適的探針加入量
        3.5.2 探針標(biāo)記可定量分析微管自身動態(tài)性
    3.6 探針標(biāo)記可用于研究微管相關(guān)蛋白的功能
        3.6.1 探針標(biāo)記不會干擾EB1和MCAK對微管崩塌的調(diào)控
        3.6.2 探針標(biāo)記不會干擾chTOG對微管聚合解聚的調(diào)控
        3.6.3 探針標(biāo)記不會干擾Kinesin-1 的滑動和DCX與微管的結(jié)合
    3.7 探針標(biāo)記可用于微管密碼調(diào)控微管動態(tài)性研究的應(yīng)用示例
        3.7.1 敲低微管乙�；齻�修飾酶及微管乙�；綑z測
        3.7.2 探針標(biāo)記可用于研究微管乙�；{(diào)控的微管動態(tài)性
    3.8 小結(jié)和討論
第4章 標(biāo)記活細(xì)胞微管小肽片段的篩選
    4.1 噬菌體展示技術(shù)篩選出來的小肽片段
    4.2 基于微管相關(guān)蛋白篩選的小肽片
    4.3 小結(jié)和討論
第5章 未來研究和展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論著
致謝



本文編號：3685345