生物固氮是高耗能的過程,每還原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表達受到胞內嚴謹?shù)恼{控,能量合成是影響固氮基因表達的重要因素。中心碳代謝是生物體所需能量的主要來源,α-酮戊二酸是胞內碳狀態(tài)的信號分子。研究表明,微生物中氮代謝調控蛋白GlnK可通過與α-酮戊二酸結合從而感知體內碳信號并調控氮代謝基因的表達,通過直接分子對話介導碳氮代謝偶聯(lián)調控。此外,研究發(fā)現(xiàn)某些固氮菌中,固氮特異調節(jié)蛋白NifA也具有感知并結合α-酮戊二酸的能力,表明固氮基因的表達可直接響應胞內碳信號水平。施氏假單胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）是一株水稻根際聯(lián)合固氮菌,該菌在低氮、微好氧條件具有固氮能力,該菌的固氮基因表達調控機制研究比較深入,但氮代謝調控系統(tǒng)對碳信號的感應傳遞模式及調控機制仍不清楚。本研究分析了 A1501菌中氮代謝調控蛋白GlnK和NifA的蛋白序列特征,并通過同源建模、位點突變、蛋白表達及蛋白-小分子互作等方法,測定了 A1501菌中GlnK和NifA蛋白與α-酮戊二酸的分子互作,比較了 NifA蛋白與突變蛋白對固氮基因表達的影響,研究結果為深入解... 

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 生物固氮
        1.1.1 生物固氮概述
        1.1.2 影響生物固氮活性的環(huán)境因素
    1.2 固氮基因表達調控機制
        1.2.1 棕色固氮菌固氮基因表達網絡與機制
        1.2.2 肺炎克雷伯固氮基因表達網絡與機制
        1.2.3 施氏假單胞菌A1501固氮基因表達網絡與機制
    1.3 固氮調控蛋白GlnK與NifA的研究進展
        1.3.1 一般氮代謝調控PII蛋白的研究進展
        1.3.2 固氮特異正調控蛋白NifA的研究進展
    1.4 立題依據(jù)與技術路線
        1.4.1 立題依據(jù)
        1.4.2 技術路線
第二章 GlnK蛋白與α-酮戊二酸的體外互作
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液
        2.1.3 主要酶類和試劑盒
        2.1.4 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細菌基因組的提取
        2.2.2 PCR擴增
        2.2.3 蛋白表達載體的構建
        2.2.4 蛋白誘導表達及純化
        2.2.5 微量熱泳動(Microscale Thermophoresis,MST)實驗
    2.3 實驗結果
        2.3.1 GlnK生物信息學分析
        2.3.2 GlnK及其點突變蛋白表達載體的構建
        2.3.3 GlnK及其點突變蛋白的誘導表達及純化
        2.3.4 GlnK及其點突變蛋白與小分子物質α-酮戊二酸的互作
        2.3.5 GlnK與小分子物質α-酮戊二酸互作的空間結構模擬
    2.4 討論
第三章 NifA蛋白與α-酮戊二酸的體外結合
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和質粒
        3.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液
        3.1.3 主要酶和試劑盒
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 PCR擴增
        3.2.2 提取低拷貝質粒pLAFR3
        3.2.3 三親結合
        3.2.4 固氮酶活測定
        3.2.5 菌株RNA的提取
        3.2.6 反轉錄
        3.2.7 實時熒光定量(qRT-PCR)
        3.2.8 Western Blot
        3.2.9 生長曲線測定
        3.2.10 過氧化氫沖擊
        3.2.11 鹽沖擊
        3.2.12 山梨醇沖擊
        3.2.13 Swimming實驗
        3.2.14 生物膜測定
    3.3 實驗結果
        3.3.1 NifA蛋白生物信息學分析
        3.3.2 NifA及NifA-F119S蛋白表達載體的構建
        3.3.3 NifA及NifA-F119S蛋白的誘導表達及純化
        3.3.4 NifA及NifA-F119S蛋白與小分子物質α-酮戊二酸的互作
        3.3.5 NifA與小分子物質α-酮戊二酸互作的空間結構模擬
        3.3.6 野生型nifA基因及突變nifA基因回補nifA突變株的回補株構建
        3.3.7 與nifA突變株相關菌株固氮酶活測定
        3.3.8 固氮條件下野生型及nifA突變株和功能回補株中nifA和nifH基因的表達
        3.3.9 Western Blot檢測不同菌株NifH蛋白表達量
        3.3.10 nifA基因全局調控功能的鑒定
    3.4 討論
第四章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3657290