目的利用Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建影響先天性心臟病關(guān)鍵基因表達(dá)載體,為后續(xù)基因編輯工作做好前期分子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索調(diào)控先天性心臟病關(guān)鍵基因NKX2-5、GATA4、TBX5,通過(guò)生物軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)3個(gè)基因?qū)?yīng)的sgRNA。對(duì)慢性病毒載體lentiCRISPRv2進(jìn)行BsmB I單酶切,通過(guò)膠回收獲得線(xiàn)性化載體。利用T4連接酶將處理后的雙鏈sgRNA和載體連接,通過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和測(cè)序最終得到lentiCRISPRv2-NKX2-5、lentiCRISPRv2-GATA4、lentiCRISPRv2-TBX5 3種病毒表達(dá)載體。結(jié)果獲得評(píng)分最高且堿基數(shù)量合適的sgRNA,通過(guò)對(duì)表達(dá)載體的線(xiàn)性化酶切,成功去除載體中2 000 bp左右的置換片段,對(duì)連接后的載體測(cè)序顯示雙鏈sgRNA與病毒表達(dá)載體置換片段序列一致。結(jié)論利用Crispr/Cas9可成功構(gòu)建先天性心臟病關(guān)鍵基因NKX2-5、GATA4、TBX5病毒表達(dá)載體。 

【文章來(lái)源】：蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2020,46(01)

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【部分圖文】：

sgRNA序列

利用T4連接酶將sgRNA雙鏈和載體長(zhǎng)片段混勻后置于4°C過(guò)夜反應(yīng)，見(jiàn)圖1。反應(yīng)體系：T4連接酶1μL,T4 Buffer 5μL，回收載體2μL，目的基因2μL。12～16 h后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5a感受態(tài)，方法：將連接后的感受肽均勻涂布于LB(Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基（AMP100μg/mL），晾干后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。隔日挑選單一白色菌落接種于液體LB培養(yǎng)基（AMP100μg/mL），振蕩（37°C,150 r/min）培養(yǎng)。使用超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒，送至諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序。2 結(jié)果

利用BsmB I內(nèi)切酶分別酶切3份載體，Marker作為片段大小參照，見(jiàn)圖2；對(duì)照質(zhì)粒沒(méi)有被酶切，在酶切質(zhì)粒中分別得到一條2 000 bp左右的條帶，該條帶即為置換片段，后續(xù)工作只需回收載體長(zhǎng)片段即可。2.3 載體回收

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]NKX2-5、TBX5、GATA4基因與先天性心臟病關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 杜佳,易豈建.  兒科藥學(xué)雜志. 2018(05)
[2]Nodal信號(hào)通路、Nodal纖毛與先天性心臟病研究進(jìn)展[J]. 孫曉瑋,張建剛,謝小冬.  蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2015(04)
[3]GATA4基因多態(tài)性與先天性心臟病相關(guān)性研究[J]. 尤濤,丁兆紅,劉興光,王新寬,侯小東,丁凡,移康.  蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2015(01)



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