植物病毒病由于嚴(yán)重影響作物正常生長發(fā)育,發(fā)病后又難以防治,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,如何有效防治病毒病一直是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要問題。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主組分,進(jìn)行復(fù)制和移動(dòng),因此如何抑制其復(fù)制與移動(dòng)是防治植物病毒病的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御組分,調(diào)控植物對病、蟲與草等的抗性,但PPI對病毒的抗性研究還相對較少。NbSIPI6是一個(gè)被脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的大豆胰蛋白酶抑制子家族成員,實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)煙草NbSIPI6可抑制PVX病毒的長距離移動(dòng),增強(qiáng)本氏煙對PVX的抗性。本實(shí)驗(yàn)想進(jìn)一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此豐富PPI類基因?qū)共《镜恼J(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用NbSIPI6融合GFP的轉(zhuǎn)基因材料,分析NbSIPI6本氏煙對PVY病毒的抗性,并為亞細(xì)胞定位和后續(xù)免疫沉淀提供基礎(chǔ)。此外,分析了NbSIPI6響應(yīng)病毒與水楊酸（Salicylic acid,SA）的表達(dá)模式以及NbSIPI6對病毒基因沉默抑制子活性的影響,為探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相關(guān)作用機(jī)制提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建NbSIPI6... 

【文章來源】：浙江師范大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

NbSIPI6-GFP-1300與NbSIPI6m-GFP-1300載體PCR驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證M:DNAMarker;1-2:NbSIPI6PCR產(chǎn)物；3-4:NbSIPI6mPCR產(chǎn)物;5:NbSIPI6酶切產(chǎn)物；

第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體構(gòu)建及本氏煙遺傳轉(zhuǎn)化28圖2.3NbSIPI6本氏煙遺傳轉(zhuǎn)化過程1.預(yù)培養(yǎng)；2.分化；3.生根；4.移栽Fig.2.3TheprocessofAgrobacteriummediatedN.benthamianatransformation1:preconditioning;2:differentiation;3:rooting;4:transplanting12343.3轉(zhuǎn)基因煙草植株鑒定利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體轉(zhuǎn)入本氏煙，經(jīng)潮霉素(25mg/L)篩選后，獲得16個(gè)獨(dú)立株系(表2.2)。表2.2轉(zhuǎn)基因煙草植株統(tǒng)計(jì)由于轉(zhuǎn)基因植株存在假陽性可能，因此需對抗性植株進(jìn)行鑒定。以轉(zhuǎn)基因基因組為模板用GFP引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果在兩種基因型的總計(jì)10個(gè)轉(zhuǎn)基因植株上能擴(kuò)增出700bp左右目的條帶，初步證明目的基因已經(jīng)整合在本氏煙染色體上(表2.2、圖2.4)。獲得植株統(tǒng)計(jì)潮霉素篩選獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株數(shù)（株）PCR獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株數(shù)（株）獲得T0代陽性植株數(shù)（株）NbSIPI6超表達(dá)533NbSIPI6m超表達(dá)1177

第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體構(gòu)建及本氏煙遺傳轉(zhuǎn)化29M1234567891011121314151617圖2.4轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測圖M：DNAMarker2000；1-5：NbSIPI6超表達(dá)株系；6-16：NbSIPI6超表達(dá)突變株系；17：陰性對照；Fig.2.4Detectingofover-expressionlinesbyPCRM:2kbDNAMarker;1-5:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6lines;6-16:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6mlines;17:wildtype3.4實(shí)時(shí)定量PCR分析NbSIPI6的表達(dá)選取經(jīng)PCR鑒定的超表達(dá)NbSIPI6和NbSIPI6m陽性株系，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析靶標(biāo)基因NbSIPI6的表達(dá)，結(jié)果如圖2.5所示，陽性株系NbSIPI6表達(dá)量與野生型Nb相比有了明顯提高，在T0代顯示有極顯著差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了超表達(dá)NbSIPI6株系和超表達(dá)NbSIPI6m株系是陽性株系，從陽性株系中分別挑取三個(gè)株系，分別為NbSIPI6-GFP-1300-2、NbSIPI6-GFP-1300-4、NbSIPI6-GFP-1300-5和NbSIPI6m-GFP-1300-5、NbSIPI6m-GFP-1300-8、NbSIPI6m-GFP-1300-11。圖2.5轉(zhuǎn)基因株系中靶基因的表達(dá)Fig.2.5Expressionleveloftargetgeneintransgeniclinesandwildtype

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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