[目的]克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜。[方法]收集胚胎,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備c DNA。設(shè)計(jì)特異引物,PCR擴(kuò)增prmt5. L基因的ORF序列,連接到p CS2+載體構(gòu)建p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒,連接位點(diǎn)為EcoRⅠ和XhoⅠ。經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證成功構(gòu)建p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒。將p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得prmt5. L的反義探針。收集不同時(shí)期的爪蛙胚胎,固定并脫水后經(jīng)原位雜交檢測(cè)prmt5. L在胚胎發(fā)育中的表達(dá)情況。通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析PRMT5在進(jìn)化中的保守性。[結(jié)果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位雜交檢測(cè)了prmt5. L在早期胚胎中的時(shí)空表達(dá)譜。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)prmt5. L蛋白在進(jìn)化中非常保守。[結(jié)論]成功構(gòu)建了p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒。prmt5. L基因在胚胎發(fā)育中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)且prmt5. L蛋白在進(jìn)化中非常保守。 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù). 2020,30(01)

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

非洲爪蛙胚胎總RNA電泳圖

以制備好的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增非洲爪蛙prmt5.L基因的ORF序列，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增得到的目的片段。結(jié)果顯示，獲得特異的大小在2 kb左右的目的片段。該目的片段大小與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查得的非洲爪蛙prmt5.L基因(GenBank序列號(hào):NM＿001095149)的CDS序列大小一致。2.3 pCS2+prmt5.L重組載體的構(gòu)建以及雙酶切鑒定

將PCR產(chǎn)物純化后用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，與此同時(shí)雙酶切pCS2+載體，將酶切好的目的片段和pCS2+載體純化后連接，構(gòu)建重組載體。將該重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切提取的質(zhì)粒，電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，雙酶切產(chǎn)物有兩條帶，大于2 kb的條帶為pCS2+載體，另一條2 kb的條帶為目的片段。將雙酶切驗(yàn)證正確的重組載體送樣測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增得到的prmt5.L的ORF序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了pCS2+prmt5.L重組載體。2.4 prmt5.L反義探針的制備


本文編號(hào)：3427261