【目的】核酸外切酶I （Exonuclease 1, EXO1）是一種多功能的3’→5’外切酶,主要應用于清除DNA或RNA雙鏈分子中存在的單鏈。目前商品化的EXO1都是在大腸桿菌中誘導表達,表達量不高,且后續(xù)純化步驟復雜。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并在大腸桿菌中高效表達及純化。【方法】采用重疊PCR合成sbcB基因,通過酶切將其克隆至表達載體pET-30a上并轉化大腸桿菌BL21（DE3）,經(jīng)IPTG誘導,并對表達條件進行優(yōu)化,獲得限制性外切酶Ⅰ（EXO1）的大量表達。親和層析純化重組蛋白后對酶的活性進行研究。【結果】親和純化后獲得大量表達蛋白EXO1,大小與預測的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶為對照進行的功能驗證證實:sbcB基因表達產(chǎn)物EXO1能夠消化單鏈,但不會消化雙鏈,純化的EXO1具有很好的酶活性。【結論】依據(jù)本文方案制備的限制性外切酶Ⅰ（EXO1）產(chǎn)量高、純度高,適用于實驗室測序前PCR產(chǎn)物的處理。 

【文章來源】：西南農(nóng)業(yè)學報. 2020,33(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

sbcB基因序列

因目的基因總長1428 bp,為了提高合成成功率,分兩段進行合成。目的基因的電泳檢測結果如圖2所示,sbcb(1～22)和sbcb(21～42)的理論值分別為785和791 bp。從圖上可看出擴增的條帶大小均在750～1000 bp之間,與預期理論值基本相符,可判斷目的基因擴增成功。圖3 重組表達載體菌落

重組表達載體菌落

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3420139