先天性免疫反應(yīng)是宿主細(xì)胞應(yīng)對外源刺激物和病原菌入侵的第一道防線,這種特異性反應(yīng)依賴于廣泛分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的模式識別受體（Pattern Recognize Receptors,PRRs）。目前已發(fā)現(xiàn)的模式識別受體主要包括Toll樣受體（Toll-like receptors）、NOD樣受體（NOD-like receptors）、RIG樣受體（RIG-like receptors）。PRRs識別病原成分后,可啟始炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如NF-kB,MAPK信號通路,從而促進(jìn)白細(xì)胞介素,趨化因子等炎癥因子的釋放。NOD1和NOD2蛋白均為NOD樣受體家族成員,是細(xì)胞質(zhì)中參與先天性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵模式識別受體,在病原菌感染所致的炎癥反應(yīng)和自發(fā)性免疫疾病的發(fā)生中有重要作用,閱讀框移碼突變體可導(dǎo)致克羅恩腸病。NOD1/2蛋白的質(zhì)膜定位對于其起始炎癥反應(yīng)的功能不可或缺,有研究發(fā)現(xiàn)病原體被吞噬后,NOD1或NOD2蛋白能夠定位質(zhì)膜及于包含病原菌的內(nèi)體膜,SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族蛋白SLC15A3將脂多糖成分從內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)從而介導(dǎo)繼發(fā)性炎癥信號通路激活。然而NOD1/2的膜定位機(jī)制尚未完全被闡明。迄今未發(fā)現(xiàn)... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

不同細(xì)胞中,瞬時(shí)過表達(dá)NOD1蛋白具有細(xì)胞質(zhì)膜定位。

為了驗(yàn)證NOD1的質(zhì)膜定位不是由于過表達(dá)造成的蛋白積累。我們想進(jìn)一步檢測了人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monolclear cell,PBMC)并分化為巨噬細(xì)胞(h MDM),小鼠骨髓分離巨噬細(xì)胞(Mouse Bone marrow derived macrophage,m BMDM),并驗(yàn)證內(nèi)源NOD1蛋白的亞細(xì)胞定位。首先,我們在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)GFP.NOD1后,NOD1抗體的免疫熒光顯示有很好的共定位,因此驗(yàn)證了NOD1抗體的特異性(圖2A)。在h MDM和m BMDM中,免疫熒光結(jié)果同樣顯示出內(nèi)源NOD1有較好的質(zhì)膜定位特性(圖2B)。另外,我們想要采用生化手段驗(yàn)證NOD1的亞細(xì)胞定位。我們利用細(xì)胞組分分離試劑盒對人外周血單核細(xì)胞(THP1)和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat)進(jìn)行膜質(zhì)分離。Western Blot分析質(zhì)膜成分中NOD1表達(dá)水平,結(jié)果表明在THP1細(xì)胞(圖3A)質(zhì)膜組分和Hecat細(xì)胞(圖3B)質(zhì)膜組分中均能夠檢測到內(nèi)源NOD1蛋白。

另外,我們想要采用生化手段驗(yàn)證NOD1的亞細(xì)胞定位。我們利用細(xì)胞組分分離試劑盒對人外周血單核細(xì)胞(THP1)和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat)進(jìn)行膜質(zhì)分離。Western Blot分析質(zhì)膜成分中NOD1表達(dá)水平,結(jié)果表明在THP1細(xì)胞(圖3A)質(zhì)膜組分和Hecat細(xì)胞(圖3B)質(zhì)膜組分中均能夠檢測到內(nèi)源NOD1蛋白。3.2 NOD1蛋白能夠發(fā)生棕櫚�；揎�


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