目的:細(xì)菌外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）含有大量的細(xì)菌性抗原并具有佐劑作用,能夠有效地激活免疫系統(tǒng),被譽(yù)為極具潛力的疫苗候選;當(dāng)前,鮑曼不動(dòng)桿菌引起的院內(nèi)感染備受關(guān)注,多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌更被視為“監(jiān)護(hù)室的噩夢(mèng)”,對(duì)住院病人構(gòu)成極大威脅,也給醫(yī)院內(nèi)感染的控制帶來了困難。本課題旨在分離鮑曼不動(dòng)桿菌的OMVs,分析其對(duì)在天然和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用的樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用,探討鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs作為疫苗的作用機(jī)制及其用于防控鮑曼不動(dòng)桿菌感染的可能性。方法:（1）鮑曼不動(dòng)桿菌外膜囊泡的分離提取:常規(guī)培養(yǎng)細(xì)菌并經(jīng)差速離心法分離細(xì)菌外膜囊泡,通過透射電鏡分析、SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色等相關(guān)方法進(jìn)行細(xì)菌外膜囊泡鑒定。（2）細(xì)菌外膜囊泡刺激濃度的確定:將分離的細(xì)菌外膜囊泡進(jìn)行系列稀釋,取不同濃度的外膜囊泡處理髓源性樹突狀細(xì)胞,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,以不影響樹突狀細(xì)胞存活率的最高細(xì)菌囊泡用量確定為擬用刺激濃度（10μg/mL）。（3）鮑曼不動(dòng)桿菌外膜囊泡刺激的髓源樹突狀細(xì)胞功能分析:經(jīng)確定濃度的（10μg/mL）外膜囊泡處理髓源性樹突狀... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

細(xì)菌外膜囊泡結(jié)構(gòu)[33]

鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs調(diào)控樹突狀細(xì)胞參與抗感染的作用及機(jī)制6T細(xì)胞活化、促進(jìn)B細(xì)胞增殖并分泌無關(guān)抗體等作用，這些作用將抑制宿主免疫功能，促進(jìn)細(xì)菌的生存與發(fā)展。因此，使用合適的技術(shù)或方法來修飾細(xì)菌外膜囊泡從而使之發(fā)揮有效的免疫保護(hù)作用，是細(xì)菌外膜囊泡研究的關(guān)鍵。同時(shí)，由于不同細(xì)菌外膜囊泡產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用的非均一性和復(fù)雜性，給細(xì)菌外膜囊泡的疫苗研究提出了挑戰(zhàn)。然而，細(xì)菌外膜囊泡的佐劑效應(yīng)，卻激發(fā)了外膜囊泡疫苗研究的興趣和希望。圖1.2細(xì)菌外膜囊泡的抗原提呈給免疫細(xì)胞的模式圖[33]Figure1.2Amodelforoutermembranevesiclesantigenpresentationtoimmunecells[33]1.3.4細(xì)菌外膜囊泡的臨床應(yīng)用前景對(duì)于免疫細(xì)胞來說，細(xì)菌外膜囊泡屬于外來的異物。因此，宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞會(huì)快速對(duì)其作出響應(yīng)，包括巨噬細(xì)胞的吞噬清除、相關(guān)固有免疫細(xì)胞分泌炎癥因子和趨化因子[73-75]。大量文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)菌外膜囊泡免疫小鼠后會(huì)刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)外膜囊泡的特異性抗體，這種適應(yīng)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，對(duì)于宿主抗病原體感染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[76-78]。就目前的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀而言，除了基于腦膜炎奈瑟菌外膜囊泡研制的疫苗被應(yīng)用于人體治療實(shí)踐，并取得了良好的治療效果外[76]，其它各種細(xì)菌外膜囊泡由于自身存在的多種局限性，并未應(yīng)用于人體感

鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs調(diào)控樹突狀細(xì)胞參與抗感染的作用及機(jī)制85使用ELISA檢測(cè)技術(shù)和PCR技術(shù)檢測(cè)外膜囊泡處理后髓源性樹突狀細(xì)胞分泌功能和相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況。6使用磁珠分選技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外膜囊泡處理后的髓源性樹突狀細(xì)胞對(duì)初始T細(xì)胞增殖分化的影響。圖1.3體外實(shí)驗(yàn)Figure1.3Experimentinvitro（2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分（圖1.4）：第一部分，按照實(shí)驗(yàn)流程對(duì)小鼠進(jìn)行外膜囊泡的免疫，每周一次共三次，最后一次免疫后三天斷頸處死小鼠后，取出脾臟進(jìn)行研磨，通過流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)分析。第二部分，分別以不同濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)小鼠的生存情況，從而確定合適的感染濃度。第三部分，使用兩種不同的外膜囊泡分別免疫小鼠，每周一次共三周。于第四周，分別尾靜脈注射合適濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌，監(jiān)測(cè)小鼠的生存情況，繪制生存曲線。


本文編號(hào)：3398037