微生物油脂因其具有生產(chǎn)周期短、可連續(xù)生產(chǎn)、可規(guī)�；米匀唤缲S富資源和脂肪酸組成易通過基因工程手段進行改造等特點,是第三代生物柴油重要的原料來源。實驗室前期構(gòu)建了微生物油脂生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）CT14,本課題在此基礎(chǔ)上進行系統(tǒng)代謝工程改造,進一步研究和探索微生物油脂合成及調(diào)控機制。首先,強化前體之一3-磷酸甘油的供給。C.glutamicum CT14只強化了脂肪酸的供給,大量脂肪酸溢出胞外造成浪費。為了平衡合成甘油三酯（TAG）兩種前體物質(zhì)的供給,減少胞外游離脂肪酸的含量,對前體3-磷酸甘油合成途徑進行了調(diào)控。涉及到的基因有g(shù)lpD、gpsA和gpp,通過發(fā)酵分析比較單個基因以及三個基因不同串聯(lián)組合表達對菌株胞內(nèi)外脂肪酸和微生物油脂合成的影響,獲得最優(yōu)的基因組合改造策略,過表達gpsA并敲除基因glpD,菌株胞外游離脂肪酸基本為零,總脂肪酸產(chǎn)量達到1.8 g/L,甘油三酯（TAG）含量有5～10%的提高。其次,強化TAG合成限速步驟。文獻表明,谷氨酸棒桿菌的基因組中沒有明確標注的GPAT功能基因。本課題對谷氨酸棒桿菌TAG合成途... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２谷氨酸棒桿菌ＡＴＣＣ１３０３２Ｉ３７丨??

■?Ｍｕｔａｎｔ?ＩｄｈＡ??＜Ａ）?］?＜ｃＴ＾＞－???????￣￣￣?ＩＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ??、￣＾??Ｇｒｏｗｔｈ?ｏｎ?ＢＴ?ｍｅｄｉｕｍ?（Ａ）?ｒｅｇｉｏｎ?（Ｃ）?ｒｅｇｉｏｎ??ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ?１０％?ｓｕｃｒｏｓｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ??？?、???ｊ?（Ａ）?ｉ??ｉ?ｉ?（ｂｉ?ｉ?￣｜ｊｃｒ＾＞??Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ?ＩｄｈＡ?ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ?Ｗｉｌｄ?ｒｙｐ＾??圖２．１基因無痕敲除過程ｌ？ｌ??Ｆｉｇ．２．１?Ｍａｒｋｅｒ－ｌｅｓｓ?ｇｅｎｅ?ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ??具體操作如下：以本論文中ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２７７７質(zhì)粒為例??ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｃｇ２７７７敲除質(zhì)粒構(gòu)建??（１）以Ｃ．ｇ／論ｍ／ｈ／ｍＡＴＣＣ?１３０３２基因組為模板，使用引物設(shè)計軟件設(shè)計兩對引物，??用引物ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ２擴增基因ｃｇ２７７７的上游片段，用引物ｃｇ２７７７－Ｄ３／Ｄ４擴增基因??ｃｇ２７７７下游片段，上下游片段大�。担埃�?ｂｐ左右；??（２）兩個擴增產(chǎn)物含有２０?ｂｐ左右的同源序列，再將上下游ＰＣＲ產(chǎn)物段按摩爾比??１：１混合作為重疊ＰＣＲ的模板，用引物ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ４進行重疊ＰＣＲ擴增，得到重疊片??段；?．??（３）引物對ｃｇ２７７７－Ｄｌ／Ｄ４分別含有處ａｌ和幼／Ｉ限制酶酶切位點，用限制性內(nèi)切酶??處〇１和幼／Ｉ將融合片段及質(zhì)粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ酶切純化，將酶切片段和載體以合適濃度??Ｔ４連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，涂布在藍白斑篩選平板上；??（４）菌落

。在設(shè)計引物時，引物ＧＣ含量設(shè)計在４０％？６０％之間，退火溫度不易??過低且每條引物退火溫度相差不能太大。??（２）基因ｇ／ｐＺ）上下游同源臂的融合??以Ｃ：?ｇ／＿ｗ／ｃ臓ＡＴＣＣ１３０３２基因組為模板，用ＮＥＢ的熱啟動Ｔａｑ聚合酶驗證ＰＣＲ??條件然后用Ｐｈｕｓｉｏｎ高保真酶大量擴增片段。用引物ｇｌｐ－Ｄｌ和ｇｌｐ－Ｄ２擴增基因ｇ／ｐＤ的??上游片段ｇｌｐＤ－Ｕ大小是５０５?ｂｐ，用引物ｇｌｐ－Ｄ３和ｇｌｐ－Ｄ４擴增基因ｇ／ｐＺ）的下游片段??ｇｌｐＤ－Ｄ大小是５４４ｂｐ?（見下圖３．２左）。將上下游片段切膠回收后作為模再利用引物對??§１卩－〇１／〇４來擴增上下游融合片段１０３２?５口（見下圖３．２右）。???＾???（Ｊ１－？ｄ２?ｄ３＾ｄ４?ｅｘＵｅｘ２?ａｘ３＋ｅｘ４?ｄｌ？ｄ２?ｄ３＋＜Ｊ４?ａｌｐＤ?＇?＂＂?ａｏｓＡ．?Ｑｐｐ?’??ｄＨ＜Ｊ４?ｅｘＨｅｘ４?ｄ１？ｄ４?，??－?＇?Ｙ＇?＇?＂Ｗｍ＇??ｒ?一、．‘．?＇：?．…?－１．５??ｉ．〇？…?一ｔａｗ?——１°??Ｗ?＾?一―?一一一—一—?肩?＇?”?一?一０．５??圖３．２妳Ｚ）基因上下游同源臂重疊ＰＣＲ??Ｆｉｇ．３．２?Ｔｈｅ?ｆｕｓｉｏｎ?ＰＣＲ?ｏｆ?ｇｌｐＤ－Ｕ?ａｎｄ?ｇｌｐＤ－Ｄ??（３）?ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｇ丨ｐＤ敲除載體構(gòu)建??將重疊ＰＣＲ產(chǎn)物片段ｇｌｐＤ－Ｕｌ）和敲除質(zhì)粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ使用ＮＥＢ的限制性內(nèi)切??酶五ｃｏＲ丨和執(zhí)〃？ｉＨＮ雙酶切后在去磷酸化，經(jīng)過純化試劑盒純化后Ｔ４酶過夜連接轉(zhuǎn)化??大腸桿菌感受態(tài)，利用驗證引物對ＰＫ１８－Ｔ１／


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