ClpP蛋白酶在原核和真核細(xì)胞中廣泛存在,發(fā)揮重要的生理功能。ClpP的功能主要包括參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量控制以維持細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定和調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育這兩個(gè)方面。在模式細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中,ClpP蛋白酶參與該細(xì)菌的生長、芽孢產(chǎn)生和生物膜形成等重要生理過程。該蛋白在蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）中的功能尚缺乏深入研究。利用根際微生物控制植物病害是植物病害綜合治理的重要組成部分。生防微生物在自然環(huán)境的穩(wěn)定存在是其發(fā)揮生防作用的前提。蠟樣芽孢桿菌0-9是一株從健康小麥根部分離獲得的一株生防菌株,對小麥紋枯病具有防治效果。研究蠟樣芽孢桿菌的生物膜形成和芽孢產(chǎn)生等分子機(jī)制,揭示其環(huán)境適應(yīng)性,有助于提高生物防治效果。通過生物信息學(xué)分析B.cereus 0-9的基因組序列,發(fā)現(xiàn)在0-9基因組中存在2個(gè)枯草芽孢桿菌clpP基因的同源基因,分別命名為:clpP1,clpP2。在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的?clpP1,?clpP2單敲除菌株的基礎(chǔ)上,利用基因同源重組構(gòu)建clpP1和clpP2的雙敲除菌株?clpP1?clpP2。通過測定不同基因敲除菌株的表型,結(jié)果顯示,與野生型菌株0-... 

【文章來源】：河南大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pMAD-chi質(zhì)粒圖譜

3 結(jié)果分析3.1 基因缺陷型菌株的構(gòu)建.1.1 基因缺陷型菌株敲除載體的驗(yàn)證 B.cereus 0-9 基因組為模板， PCR 分別擴(kuò)增出目的基因開放閱讀框（ORF）的和下游片段，上下游片段分別單酶切，80℃滅活 10 min 后。將上下游片段nI 連接酶連接，以連接產(chǎn)物為模板，用上游片段的正向引物和下游片段的反向，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入 pMAD-T7 載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建基因敲除載體段經(jīng)測序確認(rèn)敲除載體的正確性，證明敲除載體構(gòu)建成功。

圖 b 是 spx2 菌株的驗(yàn)證，M 表示 DNAMarker，1 代表野生型菌株 PCR kb，2 代表 spx2 基因組 PCR 擴(kuò)增，條帶為 2.0 kb。圖 c 是 spx1 spx2 菌株的驗(yàn)證，M 表示 DNAMarker，1 代表野生型菌株增，條帶為 2.8 kb，2 代表 clpP1 基因組 PCR 擴(kuò)增，條帶為 2.0 kb。圖 d 為 clpP1 clpP2 菌株的驗(yàn)證，M 表示 DNAMarker，1 代表野生型菌擴(kuò)增，條帶為 2.5 kb，2 代表 clpP1 clpP2 基因組 PCR 擴(kuò)增，條帶為 1陷型菌株構(gòu)建成功。將驗(yàn)證正確的缺陷型菌株基因組大量擴(kuò)增回收，D19(Simple)進(jìn)行測序，再次驗(yàn)證其正確性。

【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]蠟樣芽孢桿菌蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)ClpX/Hsp100家族組分的生理功能分析[D]. 熊曦.河南大學(xué) 2017



本文編號：3358429