m⁶A是一種在mRNA和非編碼RNAs中廣泛存在的,動態(tài)且可逆的甲基化修飾。在神經發(fā)育以及神經環(huán)路形成等過程中m⁶A修飾發(fā)揮著調控作用。但是,現(xiàn)進行的研究主要是對m⁶A的甲基化修飾酶“writers（刻寫器）”和去甲基化修飾酶“erasers（擦除器）”的研究,而對m⁶A修飾的識別和結合蛋白“readers（閱讀器）”的研究很少,具體在m⁶A修飾調控小腦發(fā)育的研究中,其readers的功能和機制目前還未見報道。本課題利用神經系統(tǒng)特異性表達的Nestin-cre敲除m⁶A的writer METTL14,發(fā)現(xiàn)METTL14敲除后的小鼠體型明顯變小,小腦萎縮。鑒于敲除writer后導致嚴重的小腦發(fā)育缺陷,說明m⁶A修飾對于小腦發(fā)育至關重要。我們分別在小腦的兩類主要神經元即浦肯野細胞和顆粒細胞中分別研究m⁶A修飾,本課題主要集中研究m⁶A修飾對浦肯野細胞發(fā)育和功能的調控作用和機制。本課題利用Rosa... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

RosamT/mG小鼠在Cre陽性細胞中表達GFP的機制[86]

哈爾濱工業(yè)大學工程碩士學位論文-19-3.2L7-cre表達譜確定實驗方法（1）交配鑒定將L7-cre+/-小鼠與異性Rosa26mT/mG基因型小鼠交配，取不同時期的cre陽性和cre陰性小鼠。（2）切片觀察P0開始鑒定觀察，通過小鼠灌流固定，脫水，包埋，切片后，直接加DAPI封閉不需要孵抗體，直接可以直接在熒光顯微鏡下觀察，一直至觀察到cre陽性有GFP表達，同時對照cre陰性為無GFP表達，并且在其后的幾個時期也都有GFP表達，則第一次觀察到的時期即為L7-cre的表達時間。3.3L7-cre表達譜確定結果如圖3-2所示，綠色通道是GFP表達，藍色通道是DAPI標記細胞核，Merge是兩個通道的合并，發(fā)現(xiàn)在P0時期cre陽性GFP就已經開始表達，同窩小鼠cre陰性作為對照沒有GFP表達。3.4Pcp2-cre表達譜確定實驗方法（1）交配鑒定將Pcp2-cre+/-基因型小鼠與異性Rosa26mT/mG基因型小鼠交配，取不同時期的cre陽性和cre陰性小鼠分析。圖3-2L7-cre+/-,Rosa26mT/mG小鼠小腦GFP表達結果圖（圖中scalebar為200μm）

哈爾濱工業(yè)大學工程碩士學位論文-20-（2）切片觀察P0開始觀察，通過收集小鼠灌流固定，脫水，包埋，切片后，直接加DAPI封閉液指甲油封片不需要孵抗體，直接可以直接在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，一直至觀察到cre陽性有GFP表達，同時對照cre陰性為無GFP表達，并且在其后的幾個時期也都有GFP表達，則第一次觀察到的時期即為Pcp2-cre的表達時間。3.5Pcp2-cre表達譜確定結果如圖3-3所示，Pcp2-cre+/-與異性Rosa26mT/mG小鼠交配，收集P5、P7和P8，可以看到P5野生型和cre陽性都還未表達GFP，在P7時才開始表達GFP，同窩小鼠cre陰性作為對照沒有GFP表達，P8時期陽性表達GFP，同窩小鼠陰性對照不表達GFP。Pcp2-cre表達最早在P7，晚于L7-cre表達時期，但是由于L7/Pcp2是同一個基因，只是cre插入的外顯子不同，所以我們也對Pcp2-cre進行了分析。3.6本章小結本章主要是確定了在浦肯野細胞中特異性表達的cre的表達時間，本章實驗選擇了能夠在小鼠小腦浦肯野細胞中特異性表達的L7-cre和Pcp2-cre，利用Rosa26mT/mG報告基因鼠與L7-cre和Pcp2-cre小鼠雜交，表達GFP來確定在小鼠小腦中的表達譜，研究后發(fā)現(xiàn)L7-cre最早表達是在P0時期，而Pcp2-cre最早表達是圖3-3Pcp2-cre+/-,Rosa26mT/mG小鼠小腦GFP表達結果圖（圖中scalebar為200μm）

【參考文獻】：
期刊論文
[1]N6 -methyl-adenosine （m6 A） in RNA: An Old Modification with A Novel Epigenetic Function[J]. Yamei Niu,Xu Zhao,Yong-Sheng Wu,Ming-Ming Li,Xiu-Jie Wang,Yun-Gui Yang.  Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2013(01)



本文編號：3353862