目的提供一種制備精氨酸酶特異性多克隆抗體的方法。方法首先對(duì)雙孢蘑菇中編碼精氨酸酶的基因（AbArg）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Arg,再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL 21中誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有6×His標(biāo)簽的融合蛋白,最后用純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得抗血清。結(jié)果構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a（+）-Arg,聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明誘導(dǎo)出的融合蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)純化后得到的融合蛋白純度>90%、濃度>0.5 mg/ml。用間接ELISA法測(cè)定抗體的效價(jià)達(dá)51 200。Western印跡實(shí)驗(yàn)表明制備的多克隆抗體特異性良好,可成功識(shí)別雙孢蘑菇中的精氨酸酶蛋白。結(jié)論成功制備了精氨酸酶的多克隆抗體,為進(jìn)一步研究精氨酸代謝的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：國(guó)際藥學(xué)研究雜志. 2020,47(08)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

Ab Arg基因的PCR擴(kuò)增及重組載體的雙酶切驗(yàn)證注：A.PCR擴(kuò)增Ab Arg基因；M1.2 kb DNA marker;1.Ab Arg基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B.重組載體的雙酶切驗(yàn)證；M2.1kb DNA marker;2.重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-Arg被Eco RⅠ和HindⅢ雙酶切

對(duì)抗血清進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)非特異性吸附產(chǎn)生的雜帶較多，因此對(duì)抗血清進(jìn)行了純化。用Protein A親和層析介質(zhì)純化Anti-ARG多克隆抗體，Protein A的免疫球蛋白結(jié)合域可特異性地結(jié)合抗體的Fc區(qū)，從而去除其他抗體分子。將純化后抗體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果表明多數(shù)非特異性抗體被去除干凈，得到了純度較高的Anti-ARG抗體（圖5）。圖4 間接ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)

圖3 SDS-PAGE電泳法檢測(cè)融合蛋白的親和純化注：M.預(yù)染蛋白marker;1.菌體超聲破碎后的沉淀液；2.菌體超聲破碎后的上清液；3.與鎳柱結(jié)合后的流穿液；4～7.親和純化后的洗脫液2.6 WB分析多克隆抗體的特異性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3348223