重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification,RPA）是利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白在常溫下協(xié)同實現(xiàn)引物與模板的特異結(jié)合,以代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR熱循環(huán)中的變性和復(fù)性過程的新型恒溫體外核酸擴增技術(shù)。本研究基于RPA技術(shù)建立了轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的檢測方法,可在36.7℃恒溫條件下快速檢測到轉(zhuǎn)基因玉米TC1507中的保守區(qū)段,具有較好的特異性,其檢測靈敏度達到了10-2ng/μL,檢測時間只需5分鐘,適用于基層實驗室及現(xiàn)場快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米TC1507及其制品;此外,對于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SAU）,建立了一種基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)（RPA）快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。方法根據(jù)金黃色葡萄球菌基因保守序列設(shè)計的2對引物,以金黃色葡萄球菌陽性菌株和其他7種非金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板,考察該方法的檢測靈敏度和特異性。結(jié)果RPA快速檢測金黃色葡萄球菌方法僅需5 min,檢測靈敏度為101cfu/μL;7種非金黃色葡萄球菌均不能擴增,特異性較強。本研究建立了金黃色葡萄球菌的RPA快速檢測方法,具有... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

RPA擴增的原理

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第2章轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的RPA方法的建立17特定的設(shè)計引物軟件，因此需要人工手動根據(jù)設(shè)計原則設(shè)計引物。由此設(shè)計了3組特異性較好的引物，合成后進行引物篩眩（具體序列見表1同2.1.1）實驗結(jié)果如圖2。其中T10泳道的擴增效果較好，因此選用T10-F/T10-R作為后續(xù)RPA擴增反應(yīng)的引物。M：Marker；T6：轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T6-F/T6-R；N6：非轉(zhuǎn)基因玉米-T6-F/T6-R；T9：轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T9-F/T9-R；N6:非轉(zhuǎn)基因玉米-T9-F/T9-R；T10.轉(zhuǎn)基因玉米TC1507-T10-F/T10-R；N10.非轉(zhuǎn)基因玉米-T10-F/T10-R；2.3.2轉(zhuǎn)基因玉米TC1507RPA反應(yīng)時間優(yōu)化和溫度優(yōu)化通過比對獲取的模板和優(yōu)化后的引物，對RPA擴增反應(yīng)所需要的反應(yīng)條件進行了進一步的優(yōu)化，對RPA反應(yīng)溫度和RPA反應(yīng)時間分別進行優(yōu)化。根據(jù)參考大量文獻得知通常RPA的反應(yīng)溫度通常在32℃至42℃之間，因此我們在32℃至42℃之間按照溫度從低到高選取了11個溫度梯度進行RPA擴增試驗，實驗結(jié)果如圖3，其中在第5和第6泳道有明顯條帶，最終選取36.7℃作為最適溫度。M：Marker；1：32℃；2：32.5℃；3：33.2℃；4：34.1℃；5：35.5℃；6：36.7℃；7：37.6℃；8：38.9℃；9：40.1℃；10：41.1℃；11：41.7℃圖2TC1507RPA引物篩選結(jié)果Fig.2ScreeningofRPAprimerforTC1507圖3TC1507RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.3RPAtemperatureoptimizationofTC1507

第2章轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的RPA方法的建立上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文18同時對反應(yīng)時間做了進一步優(yōu)化，將反應(yīng)時間從5min至20min按照時間從短到長選取了4個溫度梯度分別進行RPA擴增試驗。試驗結(jié)果如圖4，其中第3、5、7泳道效果都較為理想，但第三泳道時間較短，只有8min，適合于快速檢測，其條帶也較為明亮。所用最終選取8min作為最終反應(yīng)時間。M：Marker；1：5min；2：空白對照（ddH2O）/5min；3：8min；4：空白對照（ddH2O）/8min；5：15min；6：空白對照（ddH2O）/15min；7：20min；8：空白對照（ddH2O）/20min2.3.3轉(zhuǎn)基因玉米TC1507RPA特異性驗證采用2.3.1篩選出的引物T10-F/T10-R，2.3.2優(yōu)化后的反應(yīng)溫度36.7℃，反應(yīng)時間8min作為反應(yīng)條件，對本實驗的特異性進行了檢測，由圖1的N10泳道和圖3的4泳道作為實驗特異性試驗的前提條件，分別以非轉(zhuǎn)基因玉米和ddH2O作為模板，幾乎沒有非特異性條帶，證明在實驗過程中基本可以避免實驗污染。分別對轉(zhuǎn)基因玉米TC1507、轉(zhuǎn)基因玉米BT176、轉(zhuǎn)基因玉米GA21，以及采購于市場的非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜籽、小麥和棉花抽提DNA進行RPA擴增試驗，實驗結(jié)果如圖5，僅在第1泳道有條帶，說明該體系的特異性較好。為了更加快速直觀地觀察實驗結(jié)果，在RPA擴增反應(yīng)停止后，在RPA擴增反應(yīng)0.2mL的eppendorf管中分別加入2μL的105×SYBRGreenI染料，渦旋震蕩后在陽光或者日光燈下通過肉眼觀察實驗結(jié)果，僅在第1泳道呈陽性綠色，其余泳道均為橘色，再次證實了該體系對轉(zhuǎn)基因玉米TC1507的特異性較好。圖4TC1507RPA反應(yīng)時間優(yōu)化Fig.4RPAtimeoptimizationofTC1507

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