作為一種重要的模式工業(yè)微生物和食品安全微生物,枯草芽孢桿菌在工業(yè)酶和功能營(yíng)養(yǎng)品的生產(chǎn)方面具有廣泛應(yīng)用。近年來(lái),隨著對(duì)枯草芽孢桿菌遺傳調(diào)控機(jī)制的不斷揭示,多種研究策略和技術(shù),包括基因編輯系統(tǒng)、基因回路、空間支架、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等,被用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞高效合成各種生物化學(xué)品。本文首先對(duì)基于基因編輯和基于內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)的枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞設(shè)計(jì)與構(gòu)建的策略進(jìn)行了系統(tǒng)的概述。然后,以高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖、七烯甲萘醌、核黃素、透明質(zhì)酸和β-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶為例介紹了枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞工廠的應(yīng)用。最后,從基因編輯效率提升、基因回路響應(yīng)信號(hào)拓展和基因組設(shè)計(jì)與重構(gòu)三方面對(duì)枯草芽孢桿菌底盤(pán)細(xì)胞的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與應(yīng)用進(jìn)行了展望。 

【文章來(lái)源】：合成生物學(xué). 2020,1(02)

【文章頁(yè)數(shù)】：19 頁(yè)

【部分圖文】：

CRISPRa/CRISPRi系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活和抑制的示意圖

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)（cell-free protein synthesis,CFPS），是一種相對(duì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)而言的開(kāi)放表達(dá)系統(tǒng)。它是以外源m RNA或DNA為模板，利用原核或真核細(xì)胞抽提物的酶系，添加氨基酸、RNA聚合酶和能量物質(zhì)等來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)的體外翻譯系統(tǒng)[69]（圖2）。利用無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可以提高蛋白合成的效率，還可以通過(guò)摻入非天然氨基酸，在體外表達(dá)非天然蛋白質(zhì)[70]。盡管無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)通過(guò)制備方法的優(yōu)化得到了一些改進(jìn)[71]，但這些研究大部分集中在E.coli無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的改進(jìn)上，而針對(duì)B.subtilis無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的報(bào)道較少。作為一種重要的GRAS模式生物，B.subtilis無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)可能更適用于廣泛的微生物學(xué)、合成生物學(xué)和工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用。比如，B.subtilis調(diào)控元件的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)在與體內(nèi)研究結(jié)合時(shí)可發(fā)揮協(xié)同優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)多輪無(wú)細(xì)胞表征的工作流程可導(dǎo)致設(shè)計(jì)周期的快速迭代，從而有助于在體內(nèi)進(jìn)行最終的設(shè)計(jì)[72]。由于B.subtilis 168表達(dá)的異源蛋白質(zhì)容易被其自身分泌的內(nèi)源性蛋白酶降解，因此利用B.subtilis 168無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白的能力有限，只能產(chǎn)生低產(chǎn)量的報(bào)告蛋白GFP（小于0.3μg/m L）。因此，研究人員選擇蛋白酶缺陷菌株B.subtilis WB800N作為出發(fā)菌株[73]，通過(guò)工程化啟動(dòng)子文庫(kù)表征的遺傳調(diào)控元件來(lái)優(yōu)化B.subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，對(duì)58種不同類(lèi)型啟動(dòng)子構(gòu)建的無(wú)細(xì)胞GFPmut3b體系進(jìn)行初步篩選，在體外利用B.subtilis WB800N細(xì)胞提取物一起表達(dá)GFPmut3b，通過(guò)GFPmut3b的表征確定了幾種不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的B.subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞體系[15]。改良的B.subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)能夠進(jìn)行持續(xù)數(shù)小時(shí)的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)，并產(chǎn)生多達(dá)0.8μmol/L GFPmut3b，是B.subtilis 168無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)（0.011μmol/L GFPmut3b）的72倍。最后將B.subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)應(yīng)用在誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)中，以腎素?zé)晒馑孛笧閳?bào)告蛋白，證明了B.subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)對(duì)異源蛋白的生產(chǎn)和表征具有潛在的適用性。除啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱外，影響B(tài).subtilis WB800N無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白的效率可能還包括其他因素，例如，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)過(guò)程中，產(chǎn)生的乳酸、乙酸或無(wú)機(jī)磷酸鹽會(huì)導(dǎo)致體系的p H值發(fā)生變化，這也可能對(duì)無(wú)細(xì)胞體系有害。而這些限制因素可以通過(guò)使用其他能源得以緩解，比如，麥芽糖是一種能在E.coli無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中消耗抑制性無(wú)機(jī)磷酸鹽的碳源物質(zhì)[74]。通過(guò)這些潛在抑制因素的研究可以進(jìn)一步提高B.subtilis無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的效率，從而快速、大量生產(chǎn)具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能性蛋白。

在B.subtilis中，感受態(tài)的形成受到兩種感受態(tài)因子（Com X和CFS）的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定的數(shù)目，感受態(tài)因子的濃度積累到一定臨界值時(shí)誘導(dǎo)感受態(tài)的形成[80]。由com Q編碼的Com Q蛋白經(jīng)修飾處理后，產(chǎn)生具有活性的信號(hào)分子Com X并分泌到胞外，使信號(hào)感應(yīng)蛋白Com P發(fā)生自磷酸化，隨后該酶將相應(yīng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白Com A磷酸化，磷酸化的Com A和srf操縱子結(jié)合，激活該操縱子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Com S蛋白，Com S與Clp C、Com K、Mec A蛋白一起參與接下來(lái)的信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)狀態(tài)。CSF發(fā)揮作用的方式與Com Q有一些不同，由phr編碼的CSF前體在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)后形成成熟的CSF，當(dāng)胞外的CSF濃度達(dá)到一定濃度時(shí)，通過(guò)Spo0K轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，通過(guò)抑制Rap C的活性從而促進(jìn)Com A的磷酸化，促進(jìn)感受態(tài)的形成[81]�；谏鲜鲈�，Guan等[21]利用參與信號(hào)傳導(dǎo)的srf操縱子的啟動(dòng)子Psrf A，構(gòu)建了一種不需要添加誘導(dǎo)劑的細(xì)胞密度依賴(lài)型B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)菌體的高密度生長(zhǎng)及異源蛋白氨肽酶和納豆激酶的高效表達(dá)。而芽孢的形成主要受到組氨酸激酶Kin A-E和轉(zhuǎn)錄因子Spo0A的調(diào)節(jié)：Spo0A受到群體響應(yīng)信號(hào)分子Phr-Rap的調(diào)節(jié)，經(jīng)過(guò)組氨酸激酶Kin A-E和兩個(gè)磷酸轉(zhuǎn)移蛋白Spo0F和Spo0B的作用，Spo0A被磷酸化，調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)芽孢的形成。Rap60不僅可抑制Spo0A磷酸化水平，也可以抑制Kin A的活性，而Rap60則可以被響應(yīng)細(xì)胞密度的信號(hào)分子Phr60所抑制[82]�；谠撛�，Cui等[22]在B.subtilis中開(kāi)發(fā)了一種Phr60-Rap60-Spo0A雙功能群體響應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，細(xì)胞濃度增加可同時(shí)激活和抑制多個(gè)基因模塊系統(tǒng)的表達(dá)，并將該系統(tǒng)動(dòng)態(tài)控制B.subtilis 168中七烯甲萘醌的合成途徑，驗(yàn)證了該系統(tǒng)的有效性。2.3 Ⅰ型毒素/抗毒素調(diào)控系統(tǒng)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]枯草芽孢桿菌ccpA基因敲除及對(duì)其核黃素產(chǎn)量的影響[J]. 應(yīng)明,班睿.  微生物學(xué)報(bào). 2006(01)

博士論文
[1]基因組簡(jiǎn)化枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 李楊.天津大學(xué) 2017



本文編號(hào)：3342966