以中國特有植物香格里拉水韭（Isoetes shangrilaensis X. Liu）為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析篩選出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Is PEPC）,根據(jù)該基因序列,從香格里拉水韭cDNA中克隆獲得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）的編碼基因Is PEPC,并將此基因插入pCAMBIA-2300-N-eGFP及pMD質(zhì)粒載體上,再采用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法將2個重組載體分開轉(zhuǎn)入野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）中。結(jié)果顯示:Is PEPC基因蛋白編碼序列長度為2928 bp,編碼975個氨基酸;同源性檢索分析結(jié)果表明,該蛋白與其近源物種江南卷柏（Selaginella moellendorffii Hieron.）的PEPC基因蛋白序列同源性為79.8%。對轉(zhuǎn)基因的T1代擬南芥通過抗性篩選并在gDNA水平上陽性鑒定,初步鑒定得到pC2300-N-eGFP-IsPEPC轉(zhuǎn)基因株系26個和pMD-IsPEPC轉(zhuǎn)基因株系32個。 

【文章來源】：植物科學學報. 2020,38(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物電泳圖

本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選到2個磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)序列信息，這2個基因具有PEPC家族基因典型結(jié)構(gòu)特征。將香格里拉水韭Is PEPC基因編碼的氨基酸序列與上述物種構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，2個Is PEPC被分為2類，Is PEPC在氨基酸水平與近緣種江南卷柏Sm PEPC蛋白親緣關(guān)系最近，其次與玉米和高粱(Sorghum bicolor (L.) Moench)的C4型PEPC聚在一起，為植物型PEPC (PTPC)蛋白，且玉米及高粱的C4型PEPC基因經(jīng)過轉(zhuǎn)基因驗證可提高C3植物的光合效率。而Is PEPC4在氨基酸水平與Sm PEPC4、擬南芥Atppc4、玉米ZmPEPC4、菠蘿Ac PEPC4聚為一類，為細菌型PEPC(BTPC)蛋白(圖3)。2.3 表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)Is PEPC基因擬南芥鑒定

本研究構(gòu)建香格里拉水韭表達載體，質(zhì)粒PCR檢測及酶切結(jié)果顯示，片段大小均為3 kb左右(圖4，圖5)，說明成功構(gòu)建含PEPC基因CDS全長的植物表達載體，將其命名為p C2300-N-e GFP-Is PEPC和p MD-Is PEPC。進一步利用這2種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)過農(nóng)桿菌介導的花序浸染法，將香格里拉水韭Is PEPC基因成功轉(zhuǎn)入擬南芥，并通過前后4批轉(zhuǎn)化，共獲得p C2300-N-e GFP-Is PEPC表達載體的轉(zhuǎn)基因株系26個以及p MD-Is PEPC表達載體的轉(zhuǎn)基因株系32個(圖6，圖7)。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成功轉(zhuǎn)入p C2300-N-e GFP-Is PEPC表達載體的擬南芥幼苗根部具有明顯的熒光，且亞細胞定位于細胞膜上(圖8)。圖5 表達載體酶切檢測

【參考文獻】：
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