本文對(duì)于變性泡介導(dǎo)的鏈交換擴(kuò)增（Strand Exchange Amplification,SEA）引物設(shè)計(jì)規(guī)則和快速SEA（accelerated SEA,ASEA）初步應(yīng)用和核酸雜交特異性進(jìn)行初步研究,主要的研究?jī)?nèi)容與結(jié)論如下:1.SEA引物設(shè)計(jì)策略:利用一系列Tm值的肺炎支原體引物研究引物Tm值與反應(yīng)溫度的最優(yōu)組合;通過(guò)具有不同Tm值差異的沙眼衣原體和家豬引物的擴(kuò)增效率研究引物Tm差異對(duì)擴(kuò)增效率的影響;設(shè)計(jì)肺炎支原體和沙眼衣原體引物研究G/C含量對(duì)擴(kuò)增效率的影響;根據(jù)沙眼衣原體和單增李斯特菌引物的擴(kuò)增效率研究引物自身互補(bǔ)和3’端互補(bǔ)對(duì)擴(kuò)增效率的影響;根據(jù)金黃色葡萄球菌的擴(kuò)增效率確定引物Tm值和3’末端G/C含量的優(yōu)先級(jí)。結(jié)果:引物Tm值及反應(yīng)溫度均為61℃時(shí),SEA有最高的擴(kuò)增效率;Tm值差異最小的引物對(duì)的閾值時(shí)間（Threshold time,Tt）值最低,而Tm值差異最大的引物對(duì)的Tt值最高;3’端G/C含量較高的引物表現(xiàn)出較低的Tt值;互補(bǔ)位點(diǎn)的數(shù)目與Tt值呈正相關(guān),引物擁有的總潛在互補(bǔ)位點(diǎn)最少,Tt值最低;Tm值和Tm值的差異應(yīng)優(yōu)先于3’端G/C含量。結(jié)論:SEA引物設(shè)計(jì)... 

【文章來(lái)源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

1LAMP反應(yīng)原理

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文4具有更高的靈敏度和特異性，對(duì)PCR抑制劑也顯示出更高的耐受度，得到了廣泛的認(rèn)可。LMAP反應(yīng)含有6條引物和具有鏈置換活性的Bst聚合酶，反應(yīng)首先通過(guò)兩個(gè)內(nèi)部引物和兩個(gè)外部引物形成啞鈴狀的基本反應(yīng)單元；然后通過(guò)環(huán)狀引物加速反應(yīng)，環(huán)狀引物能夠?qū)AMP反應(yīng)速度提高兩倍。4到6條引物對(duì)應(yīng)DNA序列中6至8個(gè)不同的區(qū)域，這顯示出其他檢測(cè)方法不具有的出色的特異性，LAMP原理圖如圖1.1所示。LAMP近幾年廣泛應(yīng)用于食品安全、癌癥及傳染性疾病檢測(cè)中，顯示出良好的應(yīng)用前景。通過(guò)額外添加中性紅、鈣黃綠素及金納米顆粒等試劑建立的可視化檢測(cè)手段，使得LAMP反應(yīng)成為更適用于基層單位的核酸檢測(cè)手段[24-26]。然而LAMP的易污染特性也飽受詬病，由于高靈敏度即使存在較低濃度的污染也能夠造成假陽(yáng)性報(bào)告，有課題組嘗試在引物中加入特定酶切位點(diǎn)，在反應(yīng)前對(duì)體系中存在的污染進(jìn)行酶切，而額外的內(nèi)切酶在LAMP反應(yīng)溫度下失去活性，不會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響，顯示出良好的抗污染特性[27]。LAMP反應(yīng)體系中存在大量的引物這使得引物之間很可能會(huì)形成二聚體，直接影響LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增效率。EryuWang教授詳細(xì)的探討引物二聚體對(duì)LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率的影響，并提出了計(jì)算非特異性擴(kuò)增吉布斯自由能變化的公式，提供LAMP引物設(shè)計(jì)的理論指導(dǎo)[28]。1.1.2.2變性泡介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)圖1.1.2變性泡介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增原理圖[31]Figure1.1.2theprincipleofdenaturationbubble-meditatedisothermalstrandexchangeamplification變性泡介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增是石超教授課題組在2016年提出使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在DNA雙鏈的呼吸作用下，進(jìn)行核酸擴(kuò)增[29]。該方法只使一對(duì)引物，相比較LAMP反應(yīng)3對(duì)引物而言更不容易產(chǎn)生引物二聚體，引物設(shè)計(jì)更為容

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文61.2.1.2二元探針圖1.2.1二元探針?lè)磻?yīng)原理圖[41]Figure1.2.1Schematicdiagramofbinaryprobereaction二元探針是核酸探針中重要的一員，它是在直鏈探針的基礎(chǔ)之上設(shè)計(jì)而來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)的二元探針由兩段短的核苷酸組成，并在探針末端標(biāo)記上熒光供體和熒光受體，當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶標(biāo)時(shí)，探針隨機(jī)分布在溶液中，只有熒光供體能發(fā)出熒光；當(dāng)反應(yīng)體系中存在靶標(biāo)時(shí)，識(shí)別相鄰區(qū)域的兩段探針被靶標(biāo)拉近，通過(guò)能量共振轉(zhuǎn)移作用使熒光受體發(fā)出熒光信號(hào)[42-43],二元探針?lè)磻?yīng)原理圖如圖2.1所示。只有當(dāng)兩條探針識(shí)別特異序列彼此接近時(shí)，探針才能發(fā)出檢測(cè)信號(hào)，而兩條鏈結(jié)合到同一個(gè)非特異性靶標(biāo)的可能性極低，因此二元探針具有較高的特異性。為了提高二元探針的信噪比NicholasJTurro等人開(kāi)發(fā)了三染料二元探針，他們將FRET染料對(duì)和熒光受體分別標(biāo)記在兩條探針上，有效的提高了二元探針的信噪比[44]。二元探針?lè)侄问降脑O(shè)計(jì)，使得只有兩個(gè)探針同時(shí)結(jié)合與同一個(gè)靶標(biāo)時(shí)才能報(bào)告檢測(cè)信號(hào)，這使得二元探針的雜交效率比直鏈探針更低，為此WeihongTan等人將二條探針用聚乙二醇（PEG）聚合物鏈連接，在保留二元探針高特異性的同時(shí)，提高了二元探針的雜交效率[45]。1.2.1.3分子信標(biāo)分子信標(biāo)（MB）是由一條核酸鏈形成的一種常見(jiàn)核酸探針。分子信標(biāo)的環(huán)狀部位為核酸識(shí)別區(qū)域用于識(shí)別并與特定序列結(jié)合的區(qū)域，在環(huán)狀部位的兩端具有5到6個(gè)互補(bǔ)堿基，當(dāng)反應(yīng)體系中不存在靶標(biāo)時(shí)末端互補(bǔ)堿基互補(bǔ)結(jié)合使核酸鏈形成發(fā)卡狀，將標(biāo)記在核酸鏈末端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)拉近，從而不會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射；

【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]基于鏈交換擴(kuò)增新方法對(duì)肺炎支原體核酸快速檢測(cè)方法的研究[D]. 史文強(qiáng).青島大學(xué) 2019



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