由于細(xì)胞代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,尤其是對(duì)于多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀和遺傳工具有限的生物系統(tǒng)而言,基因組進(jìn)化在微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建中起著至關(guān)重要的作用�；蚪M進(jìn)化通過(guò)人為創(chuàng)造多樣化性狀以及功能篩選的迭代循環(huán),在實(shí)驗(yàn)室中模擬且加速自然進(jìn)化的過(guò)程,從而快速獲得滿足目標(biāo)需求的進(jìn)化突變體。釀酒酵母是代謝工程中重要的底盤細(xì)胞,全基因組進(jìn)化是對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)性改造的最有效合成生物學(xué)手段之一。本文總結(jié)了基因組進(jìn)化在構(gòu)建高效的釀酒酵母細(xì)胞工廠中的技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用,包括基因組改組、轉(zhuǎn)座子插入誘變和全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程（gTME）等基于隨機(jī)突變的非理性基因組進(jìn)化以及諸如酵母寡核苷酸介導(dǎo)的基因組工程（YOGE）,真核基因組多重位點(diǎn)自動(dòng)改造技術(shù)（eMAGE）、RNAi輔助的基因組進(jìn)化方法 （RAGE）以及基于CRISPR體系的基因組規(guī)模改造技術(shù)（CHAnGE、MAGIC和MAGESTIC）等可示蹤的半理性基因組進(jìn)化,并簡(jiǎn)要介紹了基因組進(jìn)化面臨的挑戰(zhàn)和高通量篩選方法的發(fā)展前景。 

【文章來(lái)源】：合成生物學(xué). 2020,1(05)

【文章頁(yè)數(shù)】：14 頁(yè)

【部分圖文】：

釀酒酵母基因組進(jìn)化的主要技術(shù)策略

RNA干擾（RNA interference,RNAi）是一種由雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默途徑，存在于多種真核生物中，但釀酒酵母缺乏天然的RNAi機(jī)制。有研究報(bào)道，通過(guò)異源表達(dá)芽殖酵母的RNAi相關(guān)蛋白Ago1和Dcr1，在釀酒酵母中成功重構(gòu)了RNAi途徑[38]，這使得能夠利用RNAi篩選來(lái)快速了解和改造工程酵母中的復(fù)雜表型[圖2(a）]。隨后，Si等[31]開發(fā)了釀酒酵母中RNAi輔助的基因組進(jìn)化方法RAGE。在CEN.PK2-1c中引入RNAi途徑后，根據(jù)酵母基因組DNA片段構(gòu)建了雙鏈RNA庫(kù)，并利用該RNA庫(kù)篩選得到Y(jié)KU70（與端粒酶功能缺失相關(guān)的基因）突變的兩個(gè)已知和三個(gè)未知的抑制基因。同時(shí)經(jīng)過(guò)3輪迭代的RNAi篩選，對(duì)3個(gè)基因PTC6、YPRP84W和t RNAVal(AAC）同時(shí)敲降后，顯著改善了釀酒酵母對(duì)乙酸的耐受性。Xiao等[39]利用RNAi全基因組進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)通過(guò)下調(diào)SIZ1基因的表達(dá)水平，可以顯著提高釀酒酵母的糠醛耐受性。在RNAi基因組進(jìn)化的基礎(chǔ)上，Si等[32]又開發(fā)了釀酒酵母自動(dòng)化多重基因組進(jìn)化技術(shù)。根據(jù)酵母基因組構(gòu)建包括基因過(guò)表達(dá)和基因下調(diào)的全長(zhǎng)c DNA文庫(kù)，其中基因過(guò)表達(dá)調(diào)控通過(guò)全長(zhǎng)c DNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，基因下調(diào)調(diào)控通過(guò)全長(zhǎng)反義RNA的轉(zhuǎn)錄（RNAi）實(shí)現(xiàn)[圖2 (b）]。在CRISPR/Cas的幫助下，通過(guò)δ整合的方式將同源供體（donor）整合到酵母基因組上[圖2(c）]，并利用自動(dòng)化平臺(tái)進(jìn)行多輪迭代基因組進(jìn)化提高釀酒酵母乙酸耐受性，最后篩選到的菌株在1.1%乙酸濃度下，4 d內(nèi)可將20 g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化為5.9 g/L乙醇，且整個(gè)篩選過(guò)程在一個(gè)月內(nèi)就能完成。1.2.4 CHAn GE(CRISPR/Cas9-and homology-directedrepair-assisted genome-scale engineering)

利用CRISPR/Cas技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因敲除，而在核酸酶失活的Cas蛋白（d Cas）上融合表達(dá)激活域或抑制域可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活和抑制[41]。2017年，Lian等[42]開發(fā)了三功能CRISPR體系（CRISPR-AID），可以在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制以及基因敲除。其中d Lb Cpf1-VP用于轉(zhuǎn)錄激活（CRISPRa),d Sp Cas9-RD1152用于轉(zhuǎn)錄抑制（CRISPRi),Sa Cas9用于基因敲除（CRISPRd）。利用CRISPR-AID和寡核苷酸芯片技術(shù)，Lian等[34]又發(fā)展了多功能全基因組進(jìn)化技術(shù)MAGIC（圖3），構(gòu)建了最全面最多樣化的酵母基因組文庫(kù)。根據(jù)酵母基因組對(duì)基因敲除、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制分別設(shè)計(jì)不同的g RNA，構(gòu)建基因敲除、轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制3個(gè)質(zhì)粒庫(kù)，將這3個(gè)質(zhì)粒庫(kù)同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，通過(guò)高通量篩選實(shí)現(xiàn)基因組進(jìn)化，而g RNA可以作為獨(dú)特的基因條形碼，可通過(guò)二代測(cè)序進(jìn)行追蹤。利用MAGIC技術(shù)，他們鑒定了復(fù)雜表型（糠醛耐受性和蛋白表面展示）一些之前未知的遺傳決定因素。比如在5 mmol/L糠醛濃度下除了篩選到和糠醛耐受性相關(guān)的已知靶點(diǎn)SIZ1和SAP30，還篩選到了之前未發(fā)現(xiàn)的新的靶點(diǎn)SLX5、NUP133、GPI17和UME1。在SIZ1基因表達(dá)水平下調(diào)的菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行第2輪進(jìn)化，一些與線粒體功能相關(guān)的靶點(diǎn)MRPL32、NAT1等被發(fā)現(xiàn)可以提高糠醛耐受性，但這些靶點(diǎn)依賴SIZ1基因的下調(diào)。第3輪進(jìn)化在SIZ1基因表達(dá)水平下調(diào)及NAT1基因表達(dá)水平激活的菌株上進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)PDR1基因表達(dá)水平的下調(diào)可以進(jìn)一步提高糠醛耐受性。最后經(jīng)過(guò)3輪進(jìn)化的酵母菌能在17.5 mmol/L糠醛濃度下，兩天內(nèi)消耗掉大部分的葡萄糖（初始濃度20 g/L），且乙醇的最終濃度與對(duì)照菌株相當(dāng)，說(shuō)明該工程酵母菌株的中心代謝并沒有明顯改變。1.2.6 MAGESTIC(multiplexed accurate genome editingwith short,trackable,integrated cellular barcodes)


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