鈣調(diào)蛋白磷酸酶（calcineurin,CN）是絲蘇氨酸蛋白磷酸酶家族中唯一一個受鈣離子和鈣調(diào)素調(diào)控的蛋白磷酸酶,在鈣信號傳遞中起著十分重要的作用。CN在人體各個器官都有表達(dá),參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、骨成型、肌肉發(fā)育、心血管生成和學(xué)習(xí)記憶等多種生物學(xué)進(jìn)程。臨床上CN作為免疫抑制作用靶點(diǎn),開發(fā)出特異性更高的CN抑制劑將為廣大患者帶來福音。鈣調(diào)蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1（Regulator of calcineurin 1,RCAN1）是CN的內(nèi)源性抑制蛋白,負(fù)反饋調(diào)節(jié)CN的磷酸酶活力,因此研究RCAN1對CN的調(diào)控機(jī)制將為藥物開發(fā)提供新思路。本文通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)和酶動力學(xué)相結(jié)合的方法,對RCAN1抑制CN的磷酸酶活力進(jìn)行研究。首先,我們運(yùn)用分子克隆、蛋白純化相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù),獲得了高濃度、高純度的重組CN蛋白,RCAN1-4蛋白,RCAN1-4 C端58個氨基酸組成的蛋白片段（由RCAN1-4外顯子7編碼,故簡寫為RCAN1-4 ex7）。我們運(yùn)用酶動力學(xué)方法監(jiān)測了 RCAN1-4對CN的抑制,發(fā)現(xiàn)RCAN1-4以及C端ex7片段即使在飽和濃度下也不能完全抑制CN的磷酸酶活力;RCAN1-4與CN相... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２：?ＮＦＡＴ家族蛋白成員⑷??在免疫細(xì)胞中，ＣＮ－ＮＦＡＴ信號通路促進(jìn)細(xì)胞因子（幾－２，億－３，１１＾４，１１＾??

第１章?媽調(diào)蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白對鈣調(diào)蛋ｆｌ憐酸酶的調(diào)節(jié)機(jī)制研究??減弱［ｕ］。??１．２．３?鈣調(diào)蛋白磷酸酶的結(jié)構(gòu)??鈣調(diào)蛋白磷酸酶的ＣＮＡ亞基分子量約６０?ＫＤ，從Ｎ端到Ｃ端依次是催化結(jié)??構(gòu)域（Ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍｉａｎ，ＣＤ），Ｂ?亞基結(jié)合螺旋（Ｂｓｕｂｕｎｉｔｂｉｎｄｉｎｇｈｅｌｉｘ，ＢＢＨ），??ＣａＭ?結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ＣａＭ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ），自抑制結(jié)構(gòu)域（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｙ??ｄｏｍｉａｎ，ＡＩＤ），后三部分稱為?Ａ?亞基調(diào)節(jié)區(qū)（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＲＤ）。??１９９５年Ｇｒｉｆｆｉｔｈ?ＪＰ等人解析了第一個ＣＮ蛋白結(jié)構(gòu)：ＣＮ－ＦＫ５０６－ＦＫＢＰ１２復(fù)??合物結(jié)構(gòu)，但此結(jié)構(gòu)并不可見ＡＩＤ，?ＣＢＤ結(jié)構(gòu)。在隨后解析的ＣＮ結(jié)構(gòu)中可ＡＩＤ??結(jié)構(gòu)，但一直沒有解析出完整的ＣＢＤ結(jié)構(gòu)。２０１６年Ｌｉ?ＳＪ等人解析的人源ＣＮｐ??結(jié)構(gòu)，才可見一小段ＣＢＤ結(jié)構(gòu)，其結(jié)合在ＣＮＡ和ＣＮＢ亞基相互作用界面處??（圖?１－３）。??１?ｉ?＾．ｒ＇，ｕ；＂ＴＢ?Ｓ?ＨＦＥｉｒ?ＣＮＡ?Ａ??１?ｒｗ．ｒ，－，－ｒｓｉ［＾ｌｉ?ＣＮＢ?「」＾??圖１－３：人源ＣＮ０結(jié)構(gòu)示意圖??紅色區(qū)域?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域ＣＤ，藍(lán)色為ＢＢＨ，灰色為ＣＢＤ，藍(lán)綠色為ＡＩＤ，??綠色為ＣＮＢ亞基（ＰＤＢＩＤ：?４０Ｒ９）??ＣＮ的催化結(jié)構(gòu)域形狀接近于橢圓體，約３５０個氨基酸殘基。由兩個ｐ－ｓｈｅｅｔ??形成非典型的Ｐ三明治結(jié)構(gòu)，它的一側(cè)是ａ－ｈｅｌｉｘ／ｐ－ｓｔｒａｎｄ混合結(jié)構(gòu)，另一側(cè)全部??４??

鈣調(diào)蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白對鈣調(diào)蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)機(jī)制研宄?第１章??是ｃｃ－ｈｅｌｉｘ。催化核心存在一個鐵離子（Ｆｅ３＋）和一個鋅離子（Ｚｎ２＋），形成金屬離??子催化中心（圖１－３，?Ａ）。ＢＢＨ形成一段ａ螺旋，在全酶結(jié)構(gòu)中被ＣＮＢ亞基形??成的疏水口袋包埋。ＣＢＤ完整結(jié)構(gòu)在所有的ＣＮ結(jié)構(gòu)中不可見，但是在２００８年??Ｙｅ?Ｑ等人解析的ＣＢＤ片段與ＣａＭ復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，ＣＢＤ形成ａ螺旋與ＣａＭ結(jié)??合％隨后２０１４年Ｌｉ?ＳＪ等人解析人源ＣＮｐ蛋白，發(fā)現(xiàn)在ＣＢＤ中還存在一段??自抑制基序（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｓｅｇｍｅｎｔ，ＡＩＳ），ＡＩＳ結(jié)合在底物錨定位點(diǎn)，阻止底??物錨定ＣＮ［１３］。Ｃ端的ＡＩＤ形成一段ａ－ｈｅｌｉｘ，結(jié)合在催化活性中心，阻止底物進(jìn)??入活性中心（圖１－４）。??ａ??ＣＮ?ａ?ｉｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｗｉｔｈ?Ａ２３８Ｌ??謂??ｂ?ＣＮ?ｐ??＇?＂；；＼＾＾＾ｉ｝ｕＡ２２??？ｆ＇?ｊｉ??圖１－４：?ＡＩＳ同ＣＮ相互作用模式??Ａ：?ＣＮａ與Ａ２３８ＬＬｘＶＰｍｏｔｉｆ結(jié)合示意圖；Ｂ：?ＣＮＰ與ＡＩＳ結(jié)合示意圖??［Ｉ３１。ＡＩＳ?占據(jù)了?Ａ２３８Ｌ?Ｌｘ?ＶＰ?ｍｏｔｉｆ?錨定位置??鈣調(diào)蛋白磷酸酶的ＣＮＢ亞基形狀類似兩個球體，分為Ｎ－ｌｏｂｅ和Ｃ－ｌｏｂｅ。每??個ｌｏｂｅ含有兩個ＥＦ－ｈａｎｄ，每個ＥＦ－ｈａｎｄ可結(jié)合一個Ｃａ２＋，Ｎ－ｌｏｂｅ的ＥＦ－１和ＥＦ－??２與Ｃａ２＋結(jié)合能力較低，結(jié)合常數(shù)在微摩爾級別。Ｃ－Ｌｏｂｅ的ＥＦ３和ＥＦ４與Ｃａ２＋??結(jié)合能力較強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)在納摩爾級別。通常情況下，ＥＦ３和ＥＦ４緊緊結(jié)合兩個??５??


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