三種肝素酶Ⅰ的克隆表達及性質(zhì)研究
發(fā)布時間：2021-06-16 01:23
肝素酶Ⅰ（Hep Ⅰ）是一種可以特異性將肝素降解為低聚糖或不飽和二糖的多糖裂解酶,可用于低分子量肝素的制備,體外循環(huán)中肝素的消除以及肝素精確結(jié)構(gòu)的確定。本文選擇了三種不同來源的肝素酶I,構(gòu)建可溶性表達肝素酶I的大腸桿菌表達系統(tǒng),制備了三種重組肝素酶I,對其表達過程和酶學性質(zhì)進行研究,并對肝素酶I與底物肝素的作用方式進行了初步探索,主要研究內(nèi)容包括:1)選擇來源于Bacteroides eggerthii VPI T5-42B-1、Bacteroides xylanisolvens SDCC 2a和Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838的三種肝素酶I,分別命名為BeHep Ⅰ、BxHep Ⅰ和BcHep Ⅰ,各自編碼394、381和389個氨基酸殘基。成功構(gòu)建了三種pET-28a-Hep Ⅰ表達載體,通過E.coli BL21（DE3）表達可溶性肝素酶I。2)對三種重組肝素酶Ⅰ進行表達研究。誘導BeHep Ⅰ的最適IPTG濃度為0.1mM,溫度為30℃,誘導時長為6 h,得到的粗酶活力為5038 U·L-1。經(jīng)鎳柱親和純化后,得...
【文章來源】：江蘇大學江蘇省
【文章頁數(shù)】：93 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
肝素酶I-III對肝素和硫酸乙酰肝素的裂解Fig.1.1DegradationofheparinandheparinsulfatebyheparinasesI-III
三種肝素酶I的克隆表達及性質(zhì)研究202.2結(jié)果與討論2.2.1B.eggerthiiVPIT5-42B-1肝素酶I序列分析圖2.2BeHepI與其他三種肝素酶I序列比對Fig.2.2.MultiplesequencealignmentofheparinasesfromB.eggerthii(BeHepI),F.heparinum(FhHepI),B.thetaiotaomicron(BtHepI)andB.stercoris(BsHepI)從PIR（https://proteininformationresource.org）數(shù)據(jù)庫中下載來源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的HepI基因序列，利用Clustal-W[68]在線服務器對BeHepI的氨基酸序列與其他同源物進行比較，對肝素酶I的關(guān)鍵氨基酸進行分析，并使用ESPript進行作圖[69]。來源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的肝素酶I基因長度為1182bp，編碼394個氨基酸，其中1~22個氨基酸屬于信號肽序列。BeHepI的理論分子量為44.56kDa，等電點為9.55，切除信號肽后的蛋白理論分子量為42.23kDa。圖2.2結(jié)果顯示BeHepI的蛋白序列與FhHepI、BtHepI和BsHepI的蛋白序列一致性分別為62.4%、81.5%和89.3%。FhHepI的三個關(guān)鍵氨基酸Cys135、His203和Lys199（分別用▲、和標注）在BeHepI中是高度保守的。Cys135是FhHepI在裂
江蘇大學碩士學位論文21解肝素過程中重要的親核氨基酸[31]。His203是激活FhHepI通過β-消除反應催化底物肝素的關(guān)鍵氨基酸殘基，Lys199是FhHepI中兩個鈣離子結(jié)合位點之一，對于維持肝素酶I的催化活性有重要意義[70]。推測這三個氨基酸殘基在BeHepI的催化過程中同樣發(fā)揮重要的作用。2.2.2重組HepI表達載體的構(gòu)建為了驗證HepI基因是否與pET-28a載體連接成功，使用BamHI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶對連接得到的載體進行處理，如圖2.3瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)了兩個所在位置與理論值相符的條帶，分別對應于pET-28a質(zhì)粒（5369bp）和HepI目的基因片段（1128bp），驗證了pET-28a-HepI表達載體連接成功。為了確保重組質(zhì)粒沒有出現(xiàn)單點或多點突變，對質(zhì)粒載體進行基因測序，測序結(jié)果與GenBank中BeHepI序列一致，說明pET-28a-HepI表達載體構(gòu)建成功。圖2.3pET-28a-HepI表達載體雙酶切實驗（M：DNAladder；1：雙酶切產(chǎn)物）Fig.2.3DoubledigestionreactionofpET-28a-HepI(M:DNAladder,1:productionofthedoubledigestionreaction)2.2.3重組HepI表達條件的優(yōu)化2.2.3.1IPTG濃度對HepI活力的影響IPTG不會被菌體代謝因而作為乳糖的替代品用于外源蛋白的表達，IPTG在誘導目的蛋白表達時受其濃度的影響，而且會對菌體產(chǎn)生抑制作用[71]。因而使用適宜濃度的IPTG對HepI進行誘導至關(guān)重要。圖2.4.1為IPTG濃度對HepI粗
本文編號：3232083
【文章來源】：江蘇大學江蘇省
【文章頁數(shù)】：93 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
肝素酶I-III對肝素和硫酸乙酰肝素的裂解Fig.1.1DegradationofheparinandheparinsulfatebyheparinasesI-III
三種肝素酶I的克隆表達及性質(zhì)研究202.2結(jié)果與討論2.2.1B.eggerthiiVPIT5-42B-1肝素酶I序列分析圖2.2BeHepI與其他三種肝素酶I序列比對Fig.2.2.MultiplesequencealignmentofheparinasesfromB.eggerthii(BeHepI),F.heparinum(FhHepI),B.thetaiotaomicron(BtHepI)andB.stercoris(BsHepI)從PIR（https://proteininformationresource.org）數(shù)據(jù)庫中下載來源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的HepI基因序列，利用Clustal-W[68]在線服務器對BeHepI的氨基酸序列與其他同源物進行比較，對肝素酶I的關(guān)鍵氨基酸進行分析，并使用ESPript進行作圖[69]。來源于B.eggerthiiVPIT5-42B-1的肝素酶I基因長度為1182bp，編碼394個氨基酸，其中1~22個氨基酸屬于信號肽序列。BeHepI的理論分子量為44.56kDa，等電點為9.55，切除信號肽后的蛋白理論分子量為42.23kDa。圖2.2結(jié)果顯示BeHepI的蛋白序列與FhHepI、BtHepI和BsHepI的蛋白序列一致性分別為62.4%、81.5%和89.3%。FhHepI的三個關(guān)鍵氨基酸Cys135、His203和Lys199（分別用▲、和標注）在BeHepI中是高度保守的。Cys135是FhHepI在裂
江蘇大學碩士學位論文21解肝素過程中重要的親核氨基酸[31]。His203是激活FhHepI通過β-消除反應催化底物肝素的關(guān)鍵氨基酸殘基，Lys199是FhHepI中兩個鈣離子結(jié)合位點之一，對于維持肝素酶I的催化活性有重要意義[70]。推測這三個氨基酸殘基在BeHepI的催化過程中同樣發(fā)揮重要的作用。2.2.2重組HepI表達載體的構(gòu)建為了驗證HepI基因是否與pET-28a載體連接成功，使用BamHI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶對連接得到的載體進行處理，如圖2.3瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)了兩個所在位置與理論值相符的條帶，分別對應于pET-28a質(zhì)粒（5369bp）和HepI目的基因片段（1128bp），驗證了pET-28a-HepI表達載體連接成功。為了確保重組質(zhì)粒沒有出現(xiàn)單點或多點突變，對質(zhì)粒載體進行基因測序，測序結(jié)果與GenBank中BeHepI序列一致，說明pET-28a-HepI表達載體構(gòu)建成功。圖2.3pET-28a-HepI表達載體雙酶切實驗（M：DNAladder；1：雙酶切產(chǎn)物）Fig.2.3DoubledigestionreactionofpET-28a-HepI(M:DNAladder,1:productionofthedoubledigestionreaction)2.2.3重組HepI表達條件的優(yōu)化2.2.3.1IPTG濃度對HepI活力的影響IPTG不會被菌體代謝因而作為乳糖的替代品用于外源蛋白的表達，IPTG在誘導目的蛋白表達時受其濃度的影響，而且會對菌體產(chǎn)生抑制作用[71]。因而使用適宜濃度的IPTG對HepI進行誘導至關(guān)重要。圖2.4.1為IPTG濃度對HepI粗
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