發(fā)布時間：2021-02-25 13:24

　　乙酰輔酶A被廣泛應用到生物醫(yī)學研究中,使用TPP代替昂貴的ATP為輔因子合成乙酰輔酶A受到廣泛關注。新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana）來源的丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶（Tn PFOR）在大腸桿菌中進行了重組表達,分析了其酶學特性,并探討了利用嗜熱酶（TnPFOR）酶法合成乙酰輔酶A。采用pET-20b（+）載體,將新阿波羅棲熱袍菌來源的四亞基組成的嗜熱酶（Tn PFOR）在大腸桿菌中進行異源表達;通過熱處理和陰離子交換層析法純化嗜熱酶（TnPFOR）;重組表達的嗜熱酶（TnPFOR）的最適反應溫度和pH分別為90℃和6. 5,TnPFOR在90℃下孵育1h時保留了50%活性。利用嗜熱酶（Tn PFOR）,以TPP為輔酶合成了乙酰輔酶A,并探討了不同溫度、丙酮酸鈉底物濃度和反應時間對乙酰輔酶A合成的影響。得到的優(yōu)化條件為:最適反應溫度為90℃,丙酮酸鈉濃度為1. 5mmol/L,反應時間為2min。 

【文章來源】：中國生物工程雜志. 2020,40(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

Tn PFOR酶四個亞基共表達示意圖

探討了不同溫度、pH和氧氣對重組丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的影響。如圖4所示，重組表達的TnPFOR酶的最適反應溫度為90℃，最適反應p H為6.5。PFOR酶在90℃下孵育1h后，仍剩余50%以上的酶活，有很好的熱穩(wěn)定性。并且在85℃下孵育1h時保留了80%以上的活性。重組表達的TnPFOR酶對氧敏感，當TnPFOR酶在室溫下長時間暴露于空氣中時，暴露2h后其活性逐漸下降約50%，在室溫下放置3h時，下降了60%左右的酶活性，空氣中暴露5h后，重組TnPFOR酶活性降低了近80%的活性。說明該酶對氧氣敏感，有氧條件下容易失活(圖4d)。而來源于檸檬酸菌的PFOR酶最適反應溫度為50℃，該酶在50℃的半衰期為33min，為了提高酶的穩(wěn)定性，需要對酶進行固定化，固定化后的酶催化活力明顯下降。圖3 重組丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶表達和純化SDS-PAGE(a)和Native-PAGE(b)電泳圖譜

圖2 丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶基因PCR擴增結果(a)和重組質粒p ET-PFOR雙酶切驗證膠圖(b)通過加入不同濃度的乙酰輔酶A(0.01～0.1mmol/L)，反應體系中添加等量的酶，丙酮酸鈉濃度為1mmol/L，在p H 8.0和溫度90℃條件下反應，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，求得重組TnPFOR酶對乙酰輔酶A的Km值為25μmol/L,Vmax為28.6U/mg。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]大腸桿菌基因組中重疊基因注釋的機器學習優(yōu)化方法[J]. 杜明倫,黃君君,馬香,唐燕瓊,劉柱.  中國生物化學與分子生物學報. 2018(08)
[2]超嗜熱酯酶EST2在不同宿主中的異源高效表達研究[J]. 羅漫杰,謝淵,錢志剛,馮雁,楊廣宇.  中國生物工程雜志. 2014(12)
[3]大腸桿菌多基因共表達策略[J]. 馬蓉,徐昊,丁銳,敖永華,張立軍.  中國生物工程雜志. 2012(04)
[4]大腸桿菌高效表達重組蛋白策略[J]. 任增亮,堵國成,陳堅,吳敬.  中國生物工程雜志. 2007(09)



本文編號：3051038