里氏木霉（Trichoderma reesei）是生產纖維素酶的重要工業(yè)菌株,同時也可用于表達多種外源蛋白,但目前對其進行基因組編輯的技術尚不成熟,表達嚴重依賴于CBH1表達系統(tǒng)。本論文對里氏木霉中的基因組編輯進行了研究,并嘗試開發(fā)了CBH1的補充表達系統(tǒng)。本研究取得了如下結果:1.CRISPR-Cas9技術在里氏木霉的初步建立本研究通過胞內表達Cas9和體外裝載Cas9-gRNA兩種方法進行基因敲除以及在此基礎上定點插入基因的方法。首先,在里氏木霉QM9414菌株胞內表達Cas9,并轉化體外轉錄的gRNA,得到了5-FOA抗性的轉化子,ura5基因發(fā)生了脫靶的基因編輯現(xiàn)象,在靶位點下游70-和100-bp處插入/缺失9-或12-bp。其次,將胞外組裝的Cas9-gRNA和帶有pyr4標記基因的質粒共轉化到里氏木霉TU-6菌株,當靶向主要的外切纖維素酶cbh1時,發(fā)現(xiàn)在27個轉化子中有8個轉化子失去了表達CBH1的能力,這表明通過基因組編輯成功地敲除了cbh1基因。進一步的序列分析表明,在靶位點處插入了共轉化質粒、染色體基因,或兩者的混合物。此外,研究了定點插入基因的方法,在HDR介導... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas9干擾外源DNA入侵的示意圖（方銳等，2013）

院碩士學位論文 制 RNA 聚合酶和上游啟動子的結合，從而激活或抑制下游相對應的基因的表達，以此為基礎構建的生物傳感器，已經廣泛應用于大腸桿木霉及哺乳動物細胞等多種生物�；谵D錄因子的生物傳感器的結構Wang et al., 2016)利用細菌的轉錄因子 XylR 和真核生物啟動子，建立了/調節(jié)基因元件，系統(tǒng)地設計和驗證了細菌的阻遏蛋白為基礎的木糖感應母中建立了一種以細胞分選為基礎的，快速、有力的高通量篩選木糖轉糖轉運子的突變體 HXT14，在木糖的轉運能力上提高了 6.5 倍。(Ellis et al., 2012)利用枯草芽孢桿菌的轉錄抑制因子 FapR，建立了反應lonyl-CoA）濃度的生物傳感器，阻遏蛋白 FapR 的表達會抑制與脂肪酸，而丙二酰輔酶 A 濃度的變化會調控下游報告基因的轉錄，通過熒光信Teo et al., 2015)利用三種不同的細菌來源的 XylR 阻遏蛋白和合成的啟了生物傳感器，通過木糖的濃度調節(jié)熒光報告基因的表達，實驗結果響 XylR 對報告基因阻遏的能力。此外，在工程酵母細胞培養(yǎng)過程中表達量的增加。

圖 2.1 重組表達質粒 pPdc1-cas9Fig. 2.1 Recombinant expression plasmid of pPdc1-cas9選對 12 個 cas9 轉化子進行 PCR 擴增，擴增產物通過增條帶為 200-bp，除去泳道 8 和 12 之外，剩余的 9 驗。圖 2.2 PCR 鑒定里氏木霉轉化子中 cas9 基因M：DNA marker；泳道 1-12 為轉化子ration of the cas9 gene in T. reesei transformants by PCR. M: DNA

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9在絲狀真菌基因組編輯中的應用[J]. 李紅花,劉鋼.  遺傳. 2017(05)
[2]ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因組靶向編輯技術及其在植物中的應用[J]. 廖鵬飛,聶旺,余雅心,童普國,李紹波,朱友林.  基因組學與應用生物學. 2016(02)
[3]纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢[J]. 顧方媛,陳朝銀,石家驥,錢世鈞.  微生物學雜志. 2008(01)



本文編號：2927628