發(fā)布時間：2020-11-05 10:42

　　 大多數(shù)動物在遇到不利的生存條件時會延遲發(fā)育并進(jìn)入生長發(fā)育停滯的休眠狀態(tài),這為其生命延續(xù)提供保障。例如:北極熊、青蛙、刺猬等通過休眠過冬;海參、非洲肺魚、箭豬等通過休眠度過炎熱的夏季。本研究關(guān)注的昆蟲滯育也屬于一種休眠類型,滯育是生物體渡過周期性的不利于其生存環(huán)境條件的一種策略,它是昆蟲度過不良生活條件的一種重要的生理特性。根據(jù)昆蟲滯育發(fā)生的時間,可以將其分為以下四種類型:卵滯育(胚胎滯育)、幼蟲滯育、蛹滯育、成蟲滯育。家蠶由于其獨(dú)特的歷史文化和經(jīng)濟(jì)價值,長期以來都是研究者關(guān)注的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。本研究以二化性家蠶品系Dazao為實(shí)驗(yàn)對象研究家蠶胚胎滯育,二化性家蠶子代滯育受親代胚胎所處環(huán)境溫度與光照影響,25℃長光照下孵育的蠶卵化蛾后產(chǎn)下滯育卵,15℃黑暗下孵育的蠶卵化蛾后產(chǎn)下非滯育卵。家蠶滯育分子機(jī)制的研究有助于擴(kuò)大蠶業(yè)生產(chǎn),提高產(chǎn)業(yè)效率,同時在農(nóng)林業(yè)害蟲防治方面具有重大意義。本研究通過不同條件下孵育的Dazao胚胎反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期的轉(zhuǎn)錄組測序,篩選滯育相關(guān)基因,并研究這些滯育相關(guān)基因在一化和二化性家蠶胚胎期的表達(dá)模式,最后通過RNAi技術(shù)鑒定這些基因的功能。主要研究結(jié)果如下:1.Dazao胚胎反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期的轉(zhuǎn)錄組測序分析為了研究親代胚胎是如何接受外界環(huán)境刺激,并最終影響子代滯育這一問題,我們對注定產(chǎn)滯育卵25℃長光照下孵育胚胎和注定產(chǎn)非滯育卵15℃暗光照下孵育胚胎的反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示:差異基因分析在胚胎反轉(zhuǎn)期(BK25 vs BK15)鑒定到812個顯著上調(diào)表達(dá)基因,65個顯著下調(diào)表達(dá)基因;在胚胎點(diǎn)青期(HP25 vs HP15)鑒定到201個顯著上調(diào)表達(dá)基因,232個顯著下調(diào)表達(dá)基因。GO和KEGG分析顯示差異基因涉及Phototransduction–fly,Amino sugar and nucleotide sugar metaboli,Glycosaminoglycan degradation等代謝通路。此外,胚胎反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期的聚類分析得到共同差異表達(dá)基因44個,包括32個共同上調(diào)表達(dá)基因和12個共同下調(diào)表達(dá)基因,這些差異基因的注釋涉及膜結(jié)構(gòu)成分,催化活性,結(jié)合蛋白以及代謝進(jìn)程。隨機(jī)選取16個差異表達(dá)基因,通過qRT-PCR來驗(yàn)證RNA-Seq的準(zhǔn)確性,結(jié)果顯示其中15個差異基因表達(dá)上下調(diào)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致,證明測序數(shù)據(jù)的可靠性。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析結(jié)合前人研究,我們鑒定到七個滯育候選基因,包括三個熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614;兩個節(jié)律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);兩個TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273。2.滯育相關(guān)基因在一化和二化性品系家蠶胚胎期表達(dá)模式本實(shí)驗(yàn)選取一化性家蠶品系C-4,二化性家蠶品系皓月(HY)和秋豐(QF)為實(shí)驗(yàn)對象,將解除滯育的蠶卵分別在25℃光照條件下和15℃黑暗條件下孵育并取材,直至孵化。利用qRT-PCR檢測七個滯育相關(guān)基因在這三個品系家蠶胚胎期的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,三個熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)中具有相似的胚胎期表達(dá)模式:它們在25℃明催青和15℃暗催青兩種條件下具有顯著差異表達(dá),表現(xiàn)為在15℃暗催青條件下的表達(dá)量顯著高于25℃明催青條件下的表達(dá)量,而在一化性品系C-4中沒有顯著差異;滯育相關(guān)基因BGIBMGA000486和BGIBMGA003345在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)的胚胎發(fā)育中后期25℃明催青條件下的表達(dá)量顯著高于15℃暗催青條件下的表達(dá)量,而在一化性品系C-4中沒有差異;兩個TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在二化性品系皓月(HY)和秋豐(QF)中也具有相似的胚胎期表達(dá)模式,它們在胚胎發(fā)育前期25℃明催青條件下的表達(dá)量高于15℃暗催青條件下的表達(dá)量,而在一化品系C-4中沒有差異。根據(jù)這七個滯育相關(guān)基因在一化和二化性品系胚胎期的差異表達(dá)模式,我們推測這些基因可能通過調(diào)節(jié)表達(dá)量的方式參與家蠶滯育調(diào)控。節(jié)律基因和TRP家族基因在25℃明催青條件下的顯著上調(diào)表達(dá)可能是其調(diào)控家蠶滯育的原因,熱激蛋白在低溫(15℃)下的顯著上調(diào)表達(dá)可能是影響產(chǎn)下非滯育卵的原因。3.滯育相關(guān)基因的功能鑒定根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果分析和差異基因在一化和二化性品系胚胎期的差異表達(dá)模式,我們推測節(jié)律基因BGIBMGA000486(period),BGIBMGA003345(takeout);TRP家族基因BGIBMGA009272,BGIBMGA009273在25℃明催青條件下的顯著上調(diào)表達(dá)可能是其調(diào)控家蠶滯育的原因,此外,熱激蛋白基因BGIBMGA014536,BGIBMGA014618,BGIBMGA004614在低溫(15℃)下的顯著上調(diào)表達(dá)可能是影響產(chǎn)下非滯育卵的原因。因此我們進(jìn)一步利用RNAi技術(shù),在個體水平上驗(yàn)證這些基因的功能。我們對剛產(chǎn)下的二化性家蠶Dazao非滯育卵進(jìn)行滯育相關(guān)基因的dsRNA注射,并以紅色熒光蛋白基因Red和未作任何處理的蠶卵作為對照。將注射14536-dsRNA、14618-dsRNA、4614-dsRNA的蠶卵置于15℃黑暗條件下孵育,注射3345-dsRNA、486-dsRNA、9272-dsRNA、9273-dsRNA的蠶卵置于25℃光照條件下孵育,注射dsRed和未經(jīng)任何處理的蠶卵作為對照組均分在兩種條件下孵育,等待化蛾產(chǎn)卵后,統(tǒng)計(jì)子代滯育情況。當(dāng)前本部分實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中,結(jié)果有待統(tǒng)計(jì)。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q963
【部分圖文】：

促使蠶卵胚胎解除滯育而進(jìn)入胚胎發(fā)育階段[60]。育與生物節(jié)律的研究的滯育是一種世代節(jié)律現(xiàn)象，光照和溫度是影響家蠶滯育的重要因素是生物鐘基因表達(dá)的重要授時因子，因此家蠶滯育與生物節(jié)律調(diào)控具有。昆蟲生物鐘在果蠅（Drosophila melanogaster）中的研究較為透徹，律是通過一個核心反饋環(huán)路來調(diào)節(jié)：節(jié)律基因 PER 和 TIM 結(jié)合成二聚細(xì)胞核，其結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子 CLK 和 CYC 的增強(qiáng)子上來反饋調(diào)節(jié)自身時光照可通過 CRY 降解 PER-TIM 二聚體，消除對轉(zhuǎn)錄因子 CLK 和 CY用，形成一個完整的反饋環(huán)路[61-64]。昆蟲滯育的研究顯示，節(jié)律基因與昆蟲滯育有著緊密的聯(lián)系。例如，Culex pipiens）干涉 period，timeless 和 CRY2，可以阻止尖音庫蚊進(jìn)入而干涉 PDF（pigment dispersing factor）會得到相反的效果（圖 1.1）[65]；（Riptortus pedestris）中干涉生物鐘基因 period 和 CRY2，能夠使本該成蟲正常發(fā)育[66]。

圖 3.1 差異基因火山圖Figure 3.1 Volcanic map of differentially expressed genes3.3.4 反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期共同差異基因分析滯育誘導(dǎo)是一段持續(xù)的時期，短暫的溫度變化不能影響子代滯育狀況，因此，反轉(zhuǎn)期與點(diǎn)青期的聚類分析有助于篩選起持續(xù)作用的滯育相關(guān)基因，通過對這兩個時期執(zhí)行聚類分析，結(jié)果獲得共同差異表達(dá)基因 44 個，包括 32 個共同上調(diào)表達(dá)基因和 12 個共同下調(diào)表達(dá)基因（表 3.5），差異基因的注釋主要涉及膜結(jié)構(gòu)成分，催化活性，結(jié)合蛋白以及代謝進(jìn)程等。表 3.4 反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期共同差異基因Table 3.4 Gene analysis of common differences between blastokinesis phase and head pigmentation phaseExpression difference Gene_id Gene_descriptionUP- regulated BGIBMGA009047 Kazal domainBGIBMGA002624 Domain of unknown function DUF4773BGIBMGA014323Enolase C-terminal domain-like||Mandelate racemase/muconatelactonizing enzyme, N-terminal domainBGIBMGA007856 Alpha/beta hydrolase fold-3||Alpha/Beta hydrolase fold

第 3 章 不同溫度下二化性家蠶胚胎反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期轉(zhuǎn)錄組測序分析3.3.5 差異表達(dá)基因的 GO 分析Gene Ontology（簡稱 GO）是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Y選特異差異基因后，研究差異基因在 Gene Ontology 中的分布狀況，有助于闡明實(shí)驗(yàn)中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。GO 富集分析方法為 GOseq[109],此方法基于Wallenius 非中心超幾何分布（Wallenius non-central hyper-geometric distribution）。相對于普通的超幾何分布(Hyper-geometric distribution)，該分布的特點(diǎn)是從某個類別中抽取個體的概率，它不同與從某個類別之外抽取一個個體的概率，這種概率的不同是通過對基因長度的偏好性進(jìn)行估計(jì)得到的，這種方法能更為準(zhǔn)確地計(jì)算出 GO term 被差異基因富集的概率。GO term 包括三種基本分類：生物學(xué)過程（CC），細(xì)胞成分（BP）和分子功能(MF) 。GO 富集結(jié)果如圖 3.2 和圖 3.3
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2871522