花色是決定花卉觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值的重要因素,而花青素苷是影響植物花色的重要因素。二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因是花青素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵基因,編碼的DFR催化二氫堪非醇(dihydrokaempferol,DHK),二氫楊梅黃酮(dihydromyriceti,DHM),二氫櫟皮黃酮(dihydroquercetin,DHQ)三種黃烷酮生成的無(wú)色花青素是花青素和原花青素的前體物質(zhì)。因此,DFR在高等植物花色的形成過程中發(fā)揮極其重要的作用,是形成花青素苷的一個(gè)非常重要的調(diào)控點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室從橙花龍膽(Gentiana lutea L.var.aurantiaca)花瓣中克隆得到了GlaDFR1和GlaDFR2兩個(gè)基因。序列分析結(jié)果表明,兩個(gè)基因均具有完整的開放閱讀框,編碼374個(gè)氨基酸,均有NADP(H)和底物結(jié)合域,屬于NADP(H)依賴性短鏈還原酶(SDR)家族成員,GlaDFR1和GlaDFR2均為Asp型DFR。為了研究GlaDFR1和GlaDFR2的功能,分別構(gòu)建在CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的GlaDFR1和GlaDFR2基因表達(dá)載體pCAMBIA1302-GlaDFR1和pCAMBIA1302-GlaDFR2。將這兩個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌EHA105,利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過潮霉素抗性篩選獲得T1代植株,對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè)和表型觀察。提取T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明GlaDFR1和GlaDFR2成功插入轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中。采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況,結(jié)果表明GlaDFR1和GlaDFR2基因均在轉(zhuǎn)錄水平上獲得表達(dá)。通過觀察,轉(zhuǎn)基因植株的花瓣表型出現(xiàn)差異,野生型煙草花瓣顏色為粉紅色,過表達(dá)GlaDFR1和GlaDFR2的轉(zhuǎn)基因植株花瓣顏色偏紅,利用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(cè)花青素苷含量,與野生型煙草進(jìn)行對(duì)比,矢車菊色素衍生物的含量均降低,初步證明GlaDFR1和GlaDFR2具有二氫黃酮醇還原酶的功能,參與橙花龍膽花青素的合成。
【學(xué)位單位】：長(zhǎng)春師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

常見的花

形成堪非醇（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）和楊梅素（Myrice 與 DFR 競(jìng)爭(zhēng)二氫黃酮醇作為其酶的底物（圖 1.2）[12, 34]。在花青素合用下，三種無(wú)色花青素轉(zhuǎn)化成花青素，最終使植物呈現(xiàn)出不同的顏胞質(zhì)和液泡中，花青素糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）將花青素再轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨貙?duì)植物的花色及花青素的穩(wěn)定性和可溶性有著重要的作用其原因在基化的位置。Lou 等研究指出麝香蘭（Muscari）的 DFR 主要催化 DHM，因此[35]，而草莓的 DFR 以催化 DHK 為主，因此果實(shí)為紅色[36]。此外DFR 功能的缺失會(huì)使植物的組織或器官的顏色變淺或者呈現(xiàn)無(wú)色物基因工程來(lái)改變植物組織或器官的顏色許多都圍繞 DFR 開展工

在本實(shí)驗(yàn)中以橙花龍膽花瓣 DFR 基因?yàn)檠芯繉?duì)象，研究 DFR 基因的功能，揭示DFR底物特異性的分子機(jī)制以及拓寬應(yīng)用DFR基因在植物基因工程中的應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。技術(shù)路線：
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