小麥內(nèi)質網(wǎng)氧化還原酶(wEro1)具有顯著提高面粉加工品質的能力,有望成為提高面粉筋力的新型生物改良劑。但其用于工業(yè)生產(chǎn)應用,仍有一定的局限性。受催化效率、表達量、穩(wěn)定性等限制,生產(chǎn)成本相對較高。本文以wEro1為研究對象,在對野生型wEro1的基本性質進行探討的基礎上,通過理性設計對其進行分子改造,最終獲得了活性得到提升的正向突變體。同時,利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達了野生型wEro1,經(jīng)優(yōu)化后實現(xiàn)了wEro1的異源高效表達。主要研究內(nèi)容:(1)wEro1基本性質的測定。大腸桿菌重組wEro1的比酶活為201.35±14.37 U/mg;最適反應pH為7.5,最適反應溫度為35℃;在低溫和中性條件下穩(wěn)定性較好;Cu~(2+)等金屬離子對wEro1表現(xiàn)出明顯的抑制作用;SDS、Tween-20和Triton X-100對wEro1的活性都表現(xiàn)出一定的抑制作用。(2)wEro1的分子改造。以序列同源性分析和同源建模結構為指導,通過理性設計,選擇了處于活性位點或活性調(diào)控相關的9個半胱氨酸殘基進行定點突變,應用重疊延伸PCR技術實現(xiàn)了9個半胱氨酸殘基的定點突變,進一步構建了重組突變型wero1基因的原核表達載體。(3)正向突變體的篩選。在大腸桿菌表達體系中,成功可溶表達了8個突變型重組wEro1,篩選得到了5個活性得到提升的正向突變體,分別是:C105A(wEro1的第105位半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢?、C124A、C149A、C220A和C229A,其中,活性增加最為明顯的是C220A和C105A,分別增加了119.64%和101.74%的活性。(4)wEro1在畢赤酵母中的高效表達。成功構建了wEro1的真核表達載體pPICZαA-wero1,并實現(xiàn)了其在畢赤酵母GS115中的表達。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了表達條件,優(yōu)化后其表達量可達53.24?2.11 U/mL。等體積發(fā)酵液下,畢赤酵母表達系統(tǒng)表達量是大腸桿菌表達系統(tǒng)表達量的14.7倍,實現(xiàn)了wEro1的高效表達。
【學位單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

圖 1-1 Ero1 催化二硫鍵形成示意圖ure 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfide 源的 Ero1 均含有多對二硫鍵，其中兩對構成了高度保守Ero1 催化氧化過程中的電子轉移（圖 1-2）[18]。內(nèi)活性位間位置上靠近核心催化區(qū)域的輔基 FAD 分子，方便其中被氧化成二硫鍵。外活性位點包含 C-X-X-X-X-C 基序，無規(guī)卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承擔將底物半胱氨酸殘基的6]。

圖 1-1 Ero1 催化二硫鍵形成示意圖e 1-1 Pathway of Ero1 catalyzed the formation of disulfid的 Ero1 均含有多對二硫鍵，其中兩對構成了高度保守o1 催化氧化過程中的電子轉移（圖 1-2）[18]。內(nèi)活性位位置上靠近核心催化區(qū)域的輔基 FAD 分子，方便其中氧化成二硫鍵。外活性位點包含 C-X-X-X-X-C 基序規(guī)卷曲（LoopⅠ）上[4]，主要承擔將底物半胱氨酸殘基的。

第一章 緒論高活性狀態(tài)，產(chǎn)生過量過氧化氫損傷細胞[19]，然而不同來源 Ero1 的活性反是不一樣的。酵母源 Ero1 的催化機制母源 Ero1 的主體結構由十個 α 螺旋組成，核心區(qū)域上方覆蓋了由上百個氨成的柔性無規(guī)卷曲（Loop Ⅰ）[5]，其立體結構如圖 1-3 所示。它一共有 14 個基，其中 10 個在這段無規(guī)卷曲上或在無規(guī)卷曲與核心區(qū)域的連接上[1]。只有酸殘基是維持其活性所必須的，這 4 個半胱氨酸殘基可形成兩對二硫鍵：C內(nèi)活性位點）和 C100-C105（外活性位點）[20]。C352-C355 位于其輔基 FA00-C105 位于非常靈活的無規(guī)卷曲 Loop Ⅰ上。在氧化 PDI 的過程中，C100-C收底物的電子并將電子轉移給C352-C355，C352-C355再將電子轉移給輔基F將電子轉移給氧分子，整個過程伴隨著氧氣的消耗和過氧化氫的產(chǎn)生[4]。
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 王建偉;溫成志;劉全偉;;巰基氧化酶在國產(chǎn)面包粉中應用的初探[J];糧食加工;2010年03期

2 蔡盡忠;;影響外源基因在巴斯德畢赤酵母表達的因素[J];海峽藥學;2006年06期

3 趙玉蓉,金宏,陳清華,王紅權,沈維軍,朱立濤;金屬離子對飼料酶活性的影響[J];飼料研究;2004年08期

相關博士學位論文 前1條

1 劉光;重組小麥內(nèi)源酶wPDI和wErol影響面粉加工品質機理的研究[D];華南理工大學;2017年

本文編號：2859174