青蒿是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材,基源植物為菊科植物黃花蒿,本論文統(tǒng)稱其為青蒿。其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯化合物,由于青蒿素含有獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu),使得其對(duì)于治療腦型瘧疾和抗氯喹型瘧具有速效和低毒的特點(diǎn)。目前青蒿素的市場(chǎng)供應(yīng)主要還是依賴于從青蒿植株中提取,但是野生青蒿中青蒿素含量較低,且資源有限,無法滿足巨大的市場(chǎng)需求。青蒿素產(chǎn)業(yè)的一個(gè)共同目標(biāo)是開發(fā)高產(chǎn)青蒿素的青蒿新品種,隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展,尋找調(diào)控青蒿素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子能夠?yàn)榕嘤弋a(chǎn)青蒿素的優(yōu)良青蒿提供新型候選基因,應(yīng)用植物基因工程手段提高青蒿素含量和產(chǎn)量,從而降低生產(chǎn)成本,這逐漸成為近年來青蒿育種研究的熱點(diǎn)。b HLH(basic helix-loop-helix)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子,已在不同藥用植物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和研究報(bào)道,它能參與調(diào)控植物中生物堿、類黃酮和萜類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成。從青蒿中相繼篩選到的兩個(gè)b HLH類轉(zhuǎn)錄因子(Aa MYC1、Aab HLH1),對(duì)青蒿素的生物合成具有正調(diào)控作用。光敏色素作用因子(Phytochrome interacting factors,PIFs)屬于b HLH轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥PIF3(At PIF3)不僅參與光信號(hào)傳導(dǎo)過程,還能正調(diào)節(jié)花色素苷的生物合成,表明PIF3可參與調(diào)節(jié)植物次生代謝。本研究將青蒿(205個(gè))和擬南芥(165個(gè))的所有b HLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,基于青蒿全基因組分析擬從青蒿中找到與擬南芥同源的PIF3序列,確定該基因并克隆,命名為Aa PIF3。針對(duì)這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子本文采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物技術(shù)等研究方法,揭示了Aa PIF3在調(diào)控青蒿素生物合成中的功能,取得了以下研究結(jié)果:1.Aa PIF3通過直接激活A(yù)a ERF1基因的轉(zhuǎn)錄間接調(diào)控青蒿素生物合成基因Aa PIF3在青蒿分泌型腺體中表達(dá)量最高,這與青蒿素生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)模式具有較高相似性。亞細(xì)胞定位研究顯示,Aa PIF3定位于細(xì)胞核中。本文采用雙熒光素酶分析和酵母單雜交技術(shù)研究了Aa PIF3與青蒿素生物合成基因以及轉(zhuǎn)錄因子Aa ERF1基因的相互作用關(guān)系。雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Aa PIF3能夠增強(qiáng)青蒿素生物合成基因(ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1)與Aa ERF1基因啟動(dòng)子的活性,表明其對(duì)青蒿素的生物合成可能具有調(diào)控作用。隨后酵母單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示,Aa PIF3與青蒿素生物合成基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)啟動(dòng)子之間沒有直接互作;但卻與Aa ERF1基因的啟動(dòng)子有直接互作。結(jié)合雙熒光素酶和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明Aa PIF3能夠通過直接轉(zhuǎn)錄激活A(yù)a ERF1基因從而間接調(diào)控青蒿素生物合成基因的表達(dá),進(jìn)而提高青蒿素的生物合成能力。2.過表達(dá)Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量增加以p HB質(zhì)粒作為植物過表達(dá)載體,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p HB-Aa PIF3轉(zhuǎn)入至根癌農(nóng)桿菌EHA105中獲得工程菌,用葉盤法轉(zhuǎn)化野生型青蒿植株并用潮霉素篩選獲得抗性植株。在過表達(dá)Aa PIF3的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,Aa ERF1、ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1表達(dá)量呈極顯著提高(p0.01),同時(shí)青蒿素和二氫青蒿酸含量也得到極顯著提高(p0.01)。在過表達(dá)Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿中,OE-10、OE-21、OE-26株系的青蒿素含量分別達(dá)到15.91 mg/g DW(Dry Weight)、15.02 mg/g DW、15.41mg/g DW,相比野生型青蒿中的青蒿素含量(9.63 mg/g DW)分別提高了65.21%、55.97%、60.02%;二氫青蒿酸的含量比野生青蒿中其含量(0.76 mg/g DW)分別提高5.03倍、5.57倍和4.93倍,其含量分別達(dá)到了4.59 mg/g DW、4.99 mg/g DW和4.51 mg/g DW。3.干擾Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量降低以p Bin19質(zhì)粒作為植物干擾表達(dá)載體,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p Bin19-Aa PIF3轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中獲得工程菌,用葉盤法轉(zhuǎn)化野生型青蒿植株,通過卡那霉素篩選獲得抗性植株。在干擾Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,Aa ERF1、ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1表達(dá)量呈極顯著降低(p0.01),同時(shí)青蒿素和二氫青蒿酸含量也呈極顯著下降(p0.01)。在干擾Aa PIF3的轉(zhuǎn)基因青蒿中,RI-46、RI-53和RI-57株系的青蒿素含量分別為4.59 mg/g DW、4.99 mg/g DW和4.51 mg/g DW,相比野生型青蒿(9.63 mg/g DW)分別降低了52.33%、48.18%和53.16%;RI-46、RI-53、RI-57株系中二氫青蒿酸含量分別降至了0.15 mg/g DW、0.27 mg/g DW、0.14 mg/g DW,僅僅是野生型青蒿中二氫青蒿酸含量(0.76 mg/g DW)的19.74%、35.52%和18.42%。綜上所述,本文從青蒿中克隆并鑒定了一個(gè)b HLH類轉(zhuǎn)錄因子(Aa PIF3);Aa PIF3通過直接激活A(yù)a ERF1的轉(zhuǎn)錄間接調(diào)控青蒿素生物合成基因,在過表達(dá)Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量提高,干擾Aa PIF3轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量降低,這說明Aa PIF3在調(diào)控青蒿素生物合成中發(fā)揮了積極的促進(jìn)作用,通過過表達(dá)Aa PIF3基因能培育出青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2;S567.219
【部分圖文】：

圖 1-1 青蒿植株和青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu) 1-1. The plant of Artemisia annua L. and chemical structure of artemisin: the plant of Artemisia annua L.; B: the chemical structure of artemisinin.生物合成途徑的研究進(jìn)展青蒿中青蒿素的含量，國(guó)內(nèi)外掀起了研究青蒿素及其衍生物素生物合成學(xué)的研究，經(jīng)過幾十年的研究青蒿素的生物合圖 1-2）。青蒿素生物合成可以分為上游（FPP 生物合成）

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文蠟質(zhì)囊腔中[16]。組織表達(dá)模式分析表明，ADS、CYP71AV1、DBR2 和 ALD分泌型腺體中表達(dá)量最高，在花和葉片中的表達(dá)量次之，在莖和根中表，這與青蒿中各個(gè)組織的青蒿素含量表現(xiàn)出高度的一致性。ADS、CYP71和 ALDH1 在催化青蒿素生物合成過程中起著決定性的作用，因此，ADAV1、DBR2 和 ALDH1 成為青蒿素生物合成途徑中重要的調(diào)控靶點(diǎn)。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文ophyllene）、大根香葉烯（GermacreneA）和法呢烯（β-farnesene）等質(zhì)的合成與青蒿素的合成共同競(jìng)爭(zhēng) FPP。采用 RANi 技術(shù)或反義表達(dá)蒿素生物合成基因的表達(dá)，使共同底物 FPP 更多的流向青蒿素的生―截流‖策略同樣是提高青蒿素生物合成的有效方法之一。ng 等采用 RNAi 技術(shù)抑制競(jìng)爭(zhēng)性支路途徑的 SQS 基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)蒿素含量達(dá)到了對(duì)照組的 3.14 倍[39]。進(jìn)行反義表達(dá)的各種轉(zhuǎn)基因青含量均出現(xiàn)了大幅度的提高：在 antiCPS 轉(zhuǎn)基因材料中青蒿素含量比高了 77%；在 antiBFS 轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量提高了 74%；在 an蒿中青蒿素含量提高了 103%；在 antiSQS 轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素含量9]。
【參考文獻(xiàn)】

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