自然環(huán)境擁有豐富的微生物資源,目前實驗室條件下能夠培養(yǎng)的微生物只占總量的0.01%-1%。復(fù)蘇促進因子Rpf(Resuscitation promoting factor,Rpf)是首次被發(fā)現(xiàn)能夠促使休眠細菌復(fù)蘇和生長的細胞因子。石油污染長期危害自然環(huán)境和人類健康,微生物修復(fù)已成為石油污染土壤修復(fù)的主要技術(shù)之一,然而自然環(huán)境中許多有石油降解活性的微生物處于難培養(yǎng)狀態(tài)。本文通過突變技術(shù)研究紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)復(fù)蘇促進因子Rpf的生物學(xué)性質(zhì)及對休眠細胞的復(fù)蘇促進作用,探究Rpf作用機理,并將純化的重組Rpf蛋白用于自然環(huán)境中高效石油污染降解菌的分離篩選。將紅平紅球菌KB1的rpf基因重組質(zhì)粒BL21-pET-32a-rpf在大腸桿菌中高效表達,利用Ni瓊脂糖親和層析純化重組Rpf蛋白,SDS-PAGE電泳分析其表達蛋白的分子量為37 kDa,重組Rpf蛋白的溶菌酶活力為1760 U/mg,蛋白酶活力為1634 U/mg。0.1 mM的Zn~(2+)能增加溶菌酶活性,Ca~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、DTT、EDTA、PMSF等對其溶菌酶活性影響不明顯。純化的重組Rpf蛋白對紅平紅球菌KB1的生長有明顯促進作用,且能促進VBNC狀態(tài)KB1細胞的復(fù)蘇,復(fù)蘇效果隨重組Rpf蛋白濃度的增加而更加顯著。利用定點突變技術(shù)對rpf基因序列溶菌酶活性相關(guān)部分氨基酸Asp~(45),Cys~(50),Glu~(51),Thr~(60),Gln~(69),Thr~(74),Trp~(75)和Cys~(114)進行了定點突變,構(gòu)建了幾種不同Rpf氨基酸突變體質(zhì)粒,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達及Ni瓊脂糖親和層析純化,發(fā)現(xiàn)突變后的Rpf溶菌酶活性發(fā)生了不同程度改變,其中C50G+C114T突變體溶菌酶活性喪失了86.68%,D45A+E51K突變體溶菌酶活性喪失了84.43%,Q69K突變體溶菌酶活性喪失86.11%,E51A突變體活性喪失11.14%,而W75V突變體的溶菌酶活性增加了94.45%。Rpf促生長和復(fù)蘇作用與溶菌酶活性密切相關(guān),C50G+C114T突變體的促生長作用和復(fù)蘇作用消失,W75V突變體能顯著增加紅平紅球菌細胞生長及非可培養(yǎng)細胞的復(fù)蘇。將紅平紅球菌重組Rpf蛋白添加到石油污染土壤樣品中,研究了其對土壤中石油降解菌的分離效果,發(fā)現(xiàn)添加Rpf能促進土壤中石油降解微生物的分離效果。從添加Rpf的土壤樣品新分離出9株石油降解細菌,通過16S rDNA序列分析確定其分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、賴氏菌屬(Leifsonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)。用紅外測油儀測定所分離菌株對石油的降解作用,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌(Bacillus sp.)JC1、(Bacillus sp.)JD5、(Bacillus sp.)FD1、(Bacillus sp.)JP3和(Bacillus sp.)FP3的降解率為43.94%、41.58%、28.96%、44.38%和29.87%,蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)JP1和(Ochrobactrum sp.)FP1的降解率分別為36.12%和34.27%,微桿菌(Microbacterium sp.)JD2和(Microbacterium sp.)FD2的降解率為26.01%和20.46%。
【學(xué)位單位】：蘭州理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X172;X53
【部分圖文】：

紅平紅球菌 rpf 基因突變、生物活性及應(yīng)用研究表 2.2 蛋白標準曲線制作方法Table 2.2 The method of making the standard protein curve號 0 1 2 3 4 溶液（mL） 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 （mL） 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 試劑（mL） 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 度 A5950.000 0.034 0.069 0.100 0.137 表 2.2 中所得數(shù)值繪制蛋白的標準曲線如圖 2.1，蛋白濃度計算x-0.0004。

表 2.3 4-methylumbellifery 標準曲線Table 2.3 The standard curve of 4-methylumbellifery樣品 1 2 3 4 5 度（nmol/L） 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 （μL） 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00體積（μL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 液（mL） 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 光強度 0.096 0.176 0.248 0.322 0.379表 2.3 所測熒光強度繪制標準曲線如圖 2.2 所示，酶活計算式+0.106。

圖 2.3 純化 Rpf 蛋白的 SDS-PAGE 分析的 Rpf 蛋白；2：破碎上清液；3：破碎菌體沉淀；M：蛋白Fig. 2.3 SDS-PAGE analysis of puried Rpf proteinrotein；2：Broken supernatant；3：Broken cell pellet；4：pf 蛋白的 Western-Blotting 鑒定f 蛋白進行 SDS-PAGE 電泳后按照 2.1.5 步驟選擇一 與二抗 Goat Anti-rabbit IgG/HRP 進行 Western-blo陽性染色帶，如圖 2.4 所示。圖 2.4 Western-blotting 鑒定純化 Rpf 蛋白
【參考文獻】

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本文編號：2839776