發(fā)布時(shí)間：2020-09-29 11:22

　　 翅二型是昆蟲種內(nèi)形態(tài)分化的常見現(xiàn)象,廣泛存在于雙翅目、半翅目、鞘翅目以及直翅目等昆蟲類群中,主要包括“天生型翅二型”和“落翅型翅二型”兩類。翅型分化是昆蟲適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的生存應(yīng)對(duì)策略,這種形態(tài)發(fā)育可塑性一直是眾多昆蟲學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn),探究昆蟲翅型分化的分子生物學(xué)機(jī)制可為理解昆蟲適應(yīng)性進(jìn)化提供科學(xué)解釋。現(xiàn)有研究多集中在飛虱、蚜蟲等“天生型翅二型”的少數(shù)昆蟲種類中,對(duì)于直翅目和“落翅型翅二型”昆蟲的研究相對(duì)較少,尤其是對(duì)“落翅型翅二型”分化的分子調(diào)控機(jī)制尚無(wú)明確解釋。家蟋蟀(Acheta domesticus Linnaeus 1758)是直翅目蟋蟀科中的常見鳴蟲,屬于“落翅型翅二型”,性狀明顯易觀察,是研究落翅型昆蟲翅二型分化的理想材料。本文利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析以及RNA干擾等方法對(duì)家蟋蟀翅二型分化的分子調(diào)控機(jī)理展開研究,結(jié)果如下:1.家蟋蟀翅二型屬“落翅型翅二型”,且存在落翅規(guī)律。家蟋蟀羽化成蟲初期,雌雄蟲體的前后翅均發(fā)育完全,均表現(xiàn)為有后翅的“長(zhǎng)翅型”。羽化成蟲后群體內(nèi)部分個(gè)體出現(xiàn)后翅脫落現(xiàn)象。在本文研究中的飼養(yǎng)條件下,家蟋蟀成蟲后約20天,群體內(nèi)落翅個(gè)體數(shù)達(dá)到高峰,而成蟲36天后不再落翅,雌雄家蟋蟀的落翅規(guī)律基本一致,無(wú)明顯差異。落翅后的個(gè)體,與后翅直接相連接的肌肉組織形態(tài)無(wú)明顯變化。2.家蟋蟀八個(gè)生命時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。以家蟋蟀落翅高峰期為取樣時(shí)間依據(jù),選擇家蟋蟀1齡若蟲(時(shí)期I),3齡若蟲(時(shí)期II),5齡若蟲(時(shí)期III),羽化成蟲初期(時(shí)期IV),羽化成蟲后第10天(時(shí)期V)、20天(時(shí)期VI)、30天(時(shí)期VII)、40天(時(shí)期VIII)共八個(gè)時(shí)期的家蟋蟀樣本,完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得135.23Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達(dá)到5.0Gb,Q30堿基百分比在91.35%及以上;De novo組裝后共獲得141,456條Unigenes,其中長(zhǎng)度在1kb以上的Unigenes有18,771條;對(duì)Unigenes進(jìn)行功能注釋,包括與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),共獲得32,508條Unigenes的注釋結(jié)果。3.家蟋蟀翅二型分化即落翅高峰期前、中、后三個(gè)階段的差異表達(dá)基因分析結(jié)果。兩兩比較家蟋蟀落翅高峰前(時(shí)期IV+V)、中(時(shí)期VI)、后(時(shí)期VII+VIII)三個(gè)階段的差異表達(dá)基因(DEGs)。Volcano plot,MA-plot,Heatmap結(jié)果顯示:在家蟋蟀落翅高峰期時(shí)DEGs上調(diào),且表達(dá)量越高的基因差異越顯著;通過(guò)GO,COG,KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs聚類分析發(fā)現(xiàn),DEGs主要富集在“Amino acid transport and metabolism”、“ribosome,purine metabolism”和“protein processing in endoplasmic reticulum”等通路中,說(shuō)明這些DEGs主要參與家蟋蟀生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的蛋白合成與互作。上述分析結(jié)果說(shuō)明家蟋蟀的落翅型翅二型分化很可能是基因調(diào)控的結(jié)果。4.利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)篩選調(diào)控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候選基因。以家蟋蟀8個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的21,922個(gè)差異基因?yàn)閿?shù)據(jù)集,進(jìn)行基因的表達(dá)模式聚類,獲得18個(gè)模塊(用不同顏色表示,詳見4.2.2)。將18個(gè)模塊與家蟋蟀落翅規(guī)律關(guān)聯(lián)分析,篩選出表達(dá)模式與家蟋蟀落翅規(guī)律正相關(guān)系數(shù)最高的模塊為紅色模塊。在紅色模塊內(nèi)選擇表達(dá)模式與家蟋蟀落翅規(guī)律最為相近的profile 9作為關(guān)鍵profile,并以0.45為閾值篩選出具有功能注釋信息的23個(gè)基因。利用Cytoscape建立基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖,選擇MCODE值排名前三的基因作為候選基因,分別為:AdomHSP40(Heat shock protein 40)、AdomCFDP(Craniofacial development protein)、AdomDIS3L(DIS3 Like 3'-5'Exoribonuclease)。此外,profile 9內(nèi)Nylanderia fulva virus(RNA病毒)在家蟋蟀落翅高峰期的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他基因,推測(cè)家蟋蟀可能由于感染該病毒發(fā)生落翅現(xiàn)象,因此該基因也被作為候選基因。綜上,借助WGCNA的方法,共篩選出四個(gè)可能調(diào)控家蟋蟀翅二型分化即落翅的候選基因。5.RNAi候選基因后統(tǒng)計(jì)落翅率發(fā)現(xiàn):(1)胰島素受體基因與家蟋蟀翅二型分化即落翅現(xiàn)象無(wú)直接調(diào)控關(guān)系�，F(xiàn)有研究表明,胰島素受體可調(diào)控飛虱的翅型分化,本文借助家蟋蟀的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩家蟋蟀中的胰島素受體(AdomInR:Insulin receptor)作為候選基因之一,經(jīng)RNA干擾AdomInR后,與野生型組的落翅率相比統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),落翅率無(wú)顯著差異,說(shuō)明AdomInR不參與調(diào)控家蟋蟀的翅二型分化即落翅。本文中家蟋蟀與飛虱翅二型發(fā)生的本質(zhì)存在區(qū)別,所以二者翅型分化的分子調(diào)控機(jī)理可能存在差異。(2)AdomHSP40參與調(diào)控家蟋蟀翅二型分化即落翅現(xiàn)象。成功RNA干擾五個(gè)候選基因(AdomCFDP、AdomDIS3-L、AdomHSP40、AdomInR和Nylanderia fulva virus),統(tǒng)計(jì)注射dsRNA后為期40天內(nèi)不同處理組家蟋蟀的落翅率,發(fā)現(xiàn)僅ds AdomHSP40注射組,與野生型和dsGFP注射組相比,落翅率顯著降低;AdomHSP40在家蟋蟀落翅高峰期表達(dá)量上調(diào),促進(jìn)家蟋蟀落翅,而通過(guò)RNA干擾AdomHSP40,降低其表達(dá)量后,家蟋蟀的落翅率降低,說(shuō)明AdomHSP40參與調(diào)控家蟋蟀翅二型分化即落翅現(xiàn)象。熒光原位雜交(FISH)結(jié)果顯示AdomHSP40基因在家蟋蟀翅基部有表達(dá),且在落翅高峰期的已落翅家蟋蟀個(gè)體中表達(dá)量高于落翅高峰期前、后,FISH結(jié)果進(jìn)一步證明了AdomHSP40參與調(diào)控家蟋蟀落翅型翅二型分化,并初步對(duì)其作用組織進(jìn)行了定位分析。6.家蟋蟀落翅前后鳴聲及生殖器官形態(tài)差異比較結(jié)果。比較家蟋蟀落翅前后雄蟲鳴聲發(fā)現(xiàn):落翅前后家蟋蟀鳴聲的單脈沖持續(xù)時(shí)長(zhǎng)與單脈沖間隔時(shí)間存在顯著差異,說(shuō)明后翅脫落對(duì)家蟋蟀前翅的振動(dòng)發(fā)音有顯著影響;比較家蟋蟀落翅前后雌雄蟲的生殖器官形態(tài),結(jié)果顯示落翅前后精巢與卵巢形態(tài)上均無(wú)明顯變化,推測(cè)落翅對(duì)家蟋蟀生殖器官形態(tài)無(wú)明顯影響。綜上,本文以“落翅型翅二型”的直翅目昆蟲家蟋蟀為研究對(duì)象,利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等方法研究發(fā)現(xiàn)AdomHSP40參與調(diào)控家蟋蟀翅二型分化即落翅現(xiàn)象,首次對(duì)昆蟲落翅的分子機(jī)理完成基礎(chǔ)研究,可為理解昆蟲翅型分化提供科學(xué)參考依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q969
【部分圖文】：

褐飛虱(A)與隱翅蟲(B)的翅二型示意圖

2015年浙江大學(xué)張傳溪教授團(tuán)隊(duì)以褐飛虱(Nilaparvata lugens Stal)為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)胰島素受體(insulin receptor,In R)可調(diào)控飛虱的翅型分化[74]。在褐飛虱中存在InR1和InR2兩種胰島素受體,二者通過(guò)調(diào)控FOXO的活性分別調(diào)控飛虱長(zhǎng)短翅型的分化(圖1.3)。另外,在白背飛虱(Sogatella furcifera)和灰飛虱(Laodelphax striatellus)中也驗(yàn)證了胰島素受體對(duì)翅型分化的調(diào)控作用[74,75]。這是首次發(fā)現(xiàn)“天生型翅二型”昆蟲翅型分化的分子調(diào)控機(jī)制,胰島素在人體內(nèi)主要參與血糖調(diào)節(jié),而在昆蟲體內(nèi)胰島素受體參與調(diào)控翅型分化。2016年,Xinda Lin et al.對(duì)c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)通路基因的功能展開研究,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是RNA干擾還是注射JNK基因的抑制劑(inhibitor CC-401)均使四齡雌性飛虱發(fā)育為短翅型,這說(shuō)明JNK基因參與調(diào)控飛虱的長(zhǎng)短翅型分化,且具有性別特異性[76]。JNK屬于絲裂原活化酶mitogen-activated protein kinase(MAPK)家族,MAPK是調(diào)控昆蟲在紫外照射、熱源以及滲透壓等刺激下發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的保守基因[77-79],很可能也參與昆蟲的翅型分化,因此,在發(fā)現(xiàn)胰島素受體可調(diào)控昆蟲翅型分化的功能后,學(xué)者對(duì)該基因展開了相關(guān)研究。2017年,Bi-Yue Ding et al.沉默桔蚜(Aphis citricidus)體內(nèi)的兩種胰島素受體后,蚜蟲出現(xiàn)正常翅、畸形翅、發(fā)育不全翅等性狀,且分別干擾InR1、InR2或聯(lián)合干擾二者,會(huì)使得群體中的蚜蟲分別有73%、60%和87%很難從若蟲發(fā)育為正常成蟲,該結(jié)果說(shuō)明胰島素受體與桔蚜的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān),但其是否調(diào)控翅型發(fā)育還有待進(jìn)一步研究[80]。2018年,Limei Song et al.對(duì)豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)展開研究,分析有翅蚜和無(wú)翅蚜的表達(dá)差異基因。結(jié)果表明peroxisome proliferator-activated receptor(PPRA)可能與豌豆蚜的翅發(fā)育相關(guān),嗅覺(olfactory sense)信號(hào)通路基因可能參與豌豆蚜的翅二型分化,但具體作用機(jī)制尚不清楚[81]。因此,結(jié)合現(xiàn)有研究進(jìn)展,本文對(duì)家蟋蟀的胰島素受體也進(jìn)行了篩選和功能驗(yàn)證,旨在探究直翅目中落翅型昆蟲的翅型分化是否與飛虱等“天生型翅二型”昆蟲一致,即受胰島素受體基因的調(diào)控,以調(diào)整群體內(nèi)的翅型比例,進(jìn)而對(duì)種群的動(dòng)態(tài)遷移等產(chǎn)生影響。

(1)A處理組:20只/飼養(yǎng)盒(30cm×30cm×5cm),雌蟲:雄蟲=1:1,10盒為一組,三次重復(fù),共計(jì)30盒,600只蟋蟀。雌雄家蟋蟀落翅規(guī)律基本一致,在羽化成蟲后開始出現(xiàn)后翅脫落現(xiàn)象,約在成蟲后20天達(dá)到落翅高峰期,成蟲后30天開始落翅個(gè)體數(shù)逐漸回至初成蟲時(shí)水平,成蟲后36天幾乎不再落翅。家蟋蟀雌雄群體翅二型分化即落翅規(guī)律見圖2.1。A處理組中家蟋蟀落翅率的計(jì)算方法為:(2)B處理組:100只/飼養(yǎng)盒(53cm×38cm×33cm),雌蟲:雄蟲=1:1,三次重復(fù),共計(jì)300只蟋蟀。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中家蟋蟀落翅規(guī)律的趨勢(shì)與A處理組結(jié)果相同,群體內(nèi)落翅高峰期同樣在家蟋蟀羽化成蟲后20天左右,但是與A處理組相比,在B處理組的結(jié)果中,家蟋蟀60天內(nèi)落翅率顯著低于A處理組,說(shuō)明高密度抑制了家蟋蟀落翅,即有利于維持“長(zhǎng)翅型”(有后翅)個(gè)體的存在。兩種處理下家蟋蟀在羽化成蟲后60天內(nèi)的落翅率比較見圖2.2。

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