GW182又名TNRC6A,是RNA干擾過程中的核心蛋白,其與TNRC6B和TNRC6C為同源蛋白。已有研究表明,GW182可以作為骨架蛋白與AGO2(argonaute 2)及其他RNA干擾蛋白整合在一起并形成更大的蛋白復(fù)合體。但是,一直以來,研究人員大都致力于研究AGO2在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)作用,而對(duì)于TNRC6A,甚至TNRC6蛋白家族在細(xì)胞中的具體作用并沒有深入的研究和了解。鑒于此,本研究利用小RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中對(duì)TNRC6家族基因進(jìn)行了敲低和敲除,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。本研究詳細(xì)闡述了TNRC6蛋白家族在RNA干擾過程中的作用。首先利用siRNA在不同的細(xì)胞系中敲低了TNRC6蛋白的表達(dá),并檢測(cè)了其對(duì)小RNA在細(xì)胞內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控中的不同影響,包括小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平激活、轉(zhuǎn)錄水平抑制、可變剪接的影響以及miRNA介導(dǎo)的基因沉默等。本研究發(fā)現(xiàn),在這些不同的生物學(xué)過程中,只有AGO2是必不可少的,GW182/TNRC6A只參與了其中一部分生物學(xué)過程。此外,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到了TNRC6A、TNRC6B和TNRC6AB等基因敲除細(xì)胞系,并利用蛋白質(zhì)譜、RNA測(cè)序等多種手段比較鑒定了不同基因敲除細(xì)胞系中差異基因及蛋白的表達(dá),同時(shí)利用以上幾種基因敲除細(xì)胞系,較為系統(tǒng)的檢測(cè)了TNRC6蛋白在小RNA介導(dǎo)生物過程中的作用。本研究主要結(jié)果如下:(1)通過siRNA成功在多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中敲低了TNRC6基因表達(dá),并檢測(cè)了其生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn),在miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默、小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平激活、轉(zhuǎn)錄水平抑制和可變剪接等生物過程中,TNRC6蛋白參與了siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平激活基因表達(dá)和miRNA介導(dǎo)的基因沉默的部分過程。與之相比,AGO2在這些小RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控中的作用更為重要。(2)利用CRISPR/Cas9技術(shù),成功獲得TNRC6A單基因敲除細(xì)胞系,TNRC6B單基因敲除細(xì)胞系和TNRC6AB雙基因敲除細(xì)胞系。在多次嘗試TNRC6蛋白家族(TNRC6ABC)三基因敲除失敗后,本研究發(fā)現(xiàn)TNRC6AB雙基因敲除已經(jīng)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng),因此認(rèn)定TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C中至少有一個(gè)基因是維持細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的。所以本研究在TNRC6AB雙基因敲除的基礎(chǔ)上再次利用siRNA敲低TNRC6C的表達(dá),以研TNRC6家族在細(xì)胞中的功能。并且在獲得敲除細(xì)胞系后,利用蛋白質(zhì)譜和qRT-PCR分別在蛋白和mRNA水平對(duì)目的基因進(jìn)行了檢測(cè),確定了目的基因的成功敲除。此外,本研究還通過免疫熒光對(duì)TNRC6A和AGO2在HCT116野生型和基因敲除型細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),進(jìn)一步確定基因的成功敲除。(3)利用以上基因敲除型細(xì)胞系,本研究對(duì)TNRC6影響RNA干擾因子在細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)分布的作用進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明TNRC6蛋白只影響Dicer蛋白在細(xì)胞中的亞定位,對(duì)AGO2的分布沒有直接的影響。此后檢測(cè)了TNRC6在siRNA介導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)mRNA的降解和細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的降解中的作用,闡述了其在miRNA介導(dǎo)的基因沉默以及小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平激活過程中的影響。研究結(jié)果表明TNRC6并不直接作用于siRNA介導(dǎo)的基因沉默,卻在miRNA通路中具有非常重要的作用,并且其蛋白家族之間的作用是互補(bǔ)的。僅缺失TNRC6A或TNRC6B并不會(huì)影響miRNA通路的正常功能,同時(shí)缺失TNRC6A和TNRC6B對(duì)其有一定的影響,當(dāng)對(duì)TNRC6AB雙基因敲除細(xì)胞系的TNRC6C進(jìn)行敲低表達(dá)后,miR-34a在細(xì)胞中無活性,證明了TNRC6蛋白家族在miRNA通路中的重要作用。此外,只有TNRC6A參與了siRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄,而TNRC6B和TNRC6C對(duì)該過程沒有顯著影響。(4)利用RNA-seq對(duì)不同基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。與野生型細(xì)胞HCT116相比,在TNRC6A~(-/-)細(xì)胞中,顯著上調(diào)的基因有1447個(gè),并且上調(diào)基因主要富集分析中主要富集在細(xì)胞分化、形態(tài)、生長(zhǎng)及蛋白定位等信號(hào)通路上,顯著下調(diào)的基因有1190個(gè);TNRC6AB~(-/-)細(xì)胞中,有2710個(gè)基因顯著性上調(diào),有2750個(gè)顯著性下調(diào),并且大量上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞分化、形態(tài)、生長(zhǎng)及蛋白定位等信號(hào)通路上,下調(diào)基因主要富集在核糖體RNA、核糖體相關(guān)、線粒體相關(guān)的信號(hào)通路上;而在TNRC6B~(-/-)細(xì)胞中上調(diào)基因僅有270個(gè),下調(diào)基因僅有156個(gè)。結(jié)果表明TNRC6B對(duì)細(xì)胞中基因表達(dá)的影響較小,而TNRC6A的作用則非常重要,但兩者具有相輔相成的作用效果。綜上所述,TNRC6在細(xì)胞的多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用。TNRC6參與了miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默并且在該過程中起到?jīng)Q定性作用,該基因也參與了基因轉(zhuǎn)錄激活的部分過程。并且,本研究在多個(gè)層次對(duì)該基因以上功能進(jìn)行了驗(yàn)證,并通過RNA測(cè)序手段進(jìn)一步證明了該基因在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的重要性,為后期對(duì)TNRC6基因在動(dòng)物細(xì)胞水平中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述第一章 文獻(xiàn)綜述NRC6 蛋白家族胞胞質(zhì)中，小 RNA 可以調(diào)控基因的表達(dá)翻譯并控小 RNA 也可以調(diào)控基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄和可變剪接。蛋白 AGO2 (Argonaute 2)和 TNRC6A（Trinucleotid多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中被觀察到并檢測(cè)到(GNRC6A 是細(xì)胞核 RNAi 過程中的中心組織者，并ion 4)-NOT(negative on TATA-less)蛋白復(fù)合物、組互作用(Hicks et al. 2017)。

圖 1-2 GW182 在細(xì)胞中的功能(Niaz et al. 2018)Figure 1-2 Overview of the various functions of GW182 in the cell.小結(jié)NRC6 蛋白在細(xì)胞中參與了非常多且重要的生物學(xué)過程，足以證明這個(gè)。然而研究 TNRC6 蛋白的挑戰(zhàn)在于除了小 RNA 介導(dǎo)的基因沉默外，如在細(xì)胞中的具體生物學(xué)作用？如何找到更多的具有類似 GW 富集區(qū)的功且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不同亞種的 TNRC6 蛋白也需要被單獨(dú)研究。此外白如何被調(diào)控、他們的相互作用同伴以及他們?cè)诩?xì)胞中不同信號(hào)通路中是是十分重要且不容忽視的。NA干擾RNAi 簡(jiǎn)介NA 干擾（RNAi）被認(rèn)為是一種通過 microRNA (miRNAs)或小干擾As）調(diào)控靶基因 mRNA 穩(wěn)定性從而影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中蛋白轉(zhuǎn)錄的

d Meister 2013)、Dicer(Bernstein et al. 2001)和 TAR RNA 結(jié)合蛋白（ et al. 2012; Takahashi et al. 2014; Wilson et al. 2013)。TNRC6 蛋白結(jié)A 復(fù)合體(Huntzinger et al. 2010)并將其導(dǎo)向靶基因 RNA，與此同時(shí)抑制蛋白翻譯過程的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控(Djuranovic et a一種參與前體 miRNAs 剪切成成熟的雙鏈 miRNAs 過程的核糖核酸 干擾過程中，Dicer 和 TRBP 結(jié)合雙鏈 miRNAs 并協(xié)助引導(dǎo)鏈裝載于胞胞質(zhì)中 RNAi 過程具有十分重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。siRNAs 是一控制特定基因表達(dá)的重要手段，許多 siRNAs 已經(jīng)被用于治療癌癥等的臨床試驗(yàn)中(Watts et al. 2012; Yang et al. 2012)。天然的和人工s 也被證實(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞質(zhì)中能特異性干擾靶基因 RNA。有研以參與細(xì)胞核中的 RNAi 過程，并證明 AGO 和 TNRC6 蛋白等 RN細(xì)胞核中(Gagnon et al. 2014; Matsui et al. 2013; Robb et al. 2005)，這 干擾因子可能在細(xì)胞核中參與 RNA 轉(zhuǎn)錄和可變剪切。同時(shí)也有 與 AGO、 TNRC6 和 CCR4-NOT 蛋白也可以在細(xì)胞核形成有功能 et al. 2018)。

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