槐糖脂是利用微生物代謝合成的一種表面活性劑,它不僅具有日常表面活性劑所具有的增溶、乳化、潤濕、發(fā)泡、分散、降低表面張力等通用性能,而且對環(huán)境的耐受性也是極強。熊蜂生假絲酵母(Starmerella bombicola)能夠發(fā)酵生產(chǎn)槐糖脂,但槐糖脂具有酸型、內(nèi)酯型和乙�；偷炔煌愋�,結(jié)構(gòu)多樣。本文擬通過代謝工程改造,構(gòu)建高產(chǎn)單一的酸型槐糖脂的熊蜂生假絲酵母工程菌株。論文主要結(jié)果如下:(1)利用生物信息學工具,從熊蜂生假絲酵母基因組中分離出了1條可能的過氧化物酶體合成影響因子PEX10并且鑒定其功能。構(gòu)建了PEX10基因缺失菌株,該基因的缺失對十二烷和葡萄糖的代謝沒有影響,但嚴重阻礙了細胞對菜籽油的利用使得槐糖脂的產(chǎn)量也大幅度下降。(2)通過基因敲除和基因過表達的基因工程手段,構(gòu)建了SBLE基因缺失菌株和SBLE過表達菌株評價該基因功能。通過熒光定量PCR(qPCR)檢測了各菌株的SBLE基因轉(zhuǎn)錄水平,SBLE過表達菌株的SBLE的轉(zhuǎn)錄量是野生型菌株的30多倍,SBLE基因缺失菌株沒有檢測到;發(fā)酵結(jié)果顯示,SBLE基因缺失菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中只檢測到了酸型槐糖脂,SBLE過表達菌株的發(fā)酵產(chǎn)物主要是內(nèi)酯型槐糖脂,沒有檢測到酸型槐糖脂。(3)通過合理的設(shè)計,構(gòu)建了潮霉素基因重復利用系統(tǒng)。在熊蜂生假絲酵母S.bombicola半乳糖誘導型啟動子控制下,結(jié)合β-Rec絲氨酸重組酶,構(gòu)建了潮霉素抗性篩選標記自彈出系統(tǒng),該系統(tǒng)主要包括潮霉素抗性基因表達盒、β-Rec絲氨酸重組酶和兩個SIX重組位點。該系統(tǒng)的構(gòu)建實現(xiàn)了潮霉素抗性基因的自我彈出及潮霉素標記的多次使用,從而可以對熊蜂生假絲酵母進行多基因的改造。(4)在潮霉素抗性標記基因重復利用系統(tǒng)Rec-six基因編輯系統(tǒng)基礎(chǔ)上構(gòu)建了幾株高產(chǎn)酸型槐糖脂的重組菌。通過將合成內(nèi)酯型槐糖脂的關(guān)鍵基因—內(nèi)酯酶基因SBLE敲除獲得一株只產(chǎn)酸型槐糖脂的工程菌株SBSL1(Δsble::six),進一步同源過量表達葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGTB并敲除過氧化物酶體膜轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因PXA1,構(gòu)建了高產(chǎn)酸型槐糖脂的酵母工程菌。與出發(fā)菌株相比,重組熊蜂生假絲酵母發(fā)酵油酸能夠合成單一的酸型槐糖脂,而不再合成內(nèi)酯型槐糖脂,同時酸型槐糖脂的產(chǎn)量由20 g·L~(-1)提高到44g·L~(-1)。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;Q93

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本文編號：2822225