黃曲霉(Aspergillus flavus)是一種十分常見的腐生土壤真菌,是導(dǎo)致油料作物和糧食霉變的重要元兇之一,對國家農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展和世界糧食貯存造成了巨大的損失。黃曲霉也是強毒性致癌物質(zhì)黃曲霉毒素的主要產(chǎn)生真菌,黃曲霉毒素能引發(fā)人類和動物中毒甚至肝癌等病癥,對人類的健康帶來了極大的威脅。已知發(fā)現(xiàn)全局性調(diào)控因子和分生孢子色素對真菌的生長發(fā)育與次級代謝都有著重要的作用。本研究旨在探索黃曲霉全局調(diào)控因子和分生孢子色素合成基因?qū)S曲霉生長發(fā)育及次級代謝的影響。本研究中對黃曲霉中的laeB基因進(jìn)行了敲除,并通過laeB基因缺失菌株(ΔlaeB)與野生型菌株對比發(fā)現(xiàn):laeB缺失菌株表現(xiàn)出生長速率減緩、分生孢子產(chǎn)量增加、菌核的產(chǎn)生受到抑制等多種表型缺陷;而且多種次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生受到調(diào)控,特別是黃曲霉毒素B_1的產(chǎn)量顯著減少,對玉米和花生致病能力明顯下降。通過基因組數(shù)據(jù)挖掘和序列比對鑒定了黃曲霉分生孢子色素的合成基因及其基因簇,確認(rèn)分生孢子色素合成骨架基因pks1缺失菌株(Δpks1)因無法合成分生孢子色素而呈現(xiàn)白色,導(dǎo)致孢子對紫外線照射的抵御能力明顯減弱,降低了黃曲霉對玉米和花生種子的侵染能力。而黃曲霉的生長速度、孢子產(chǎn)量、菌核形成和黃曲霉素B_1產(chǎn)生則沒有顯著性變化,也不影響細(xì)胞壁完整性、水活度變化和響應(yīng)氧化脅迫。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了新型全局性調(diào)控因子LaeB對于黃曲霉的生長發(fā)育、次級代謝和致病性等方面具有調(diào)控作用,分生孢子色素基因pks1則影響黃曲霉分生孢子對紫外線照射等不利環(huán)境因子的抵抗能力和對糧食種子的侵染能力。本研究的結(jié)果對于進(jìn)一步研究黃曲霉的生長發(fā)育、次級代謝調(diào)控和對作物的致病性提供了理論基礎(chǔ),同時對黃曲霉毒素污染的防治和新型農(nóng)藥的開發(fā)有著重要的意義。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

引言的身體健康和生命安全。1.1.2 黃曲霉毒素及其危害真菌毒素是真菌在生長過程中所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其具有生物水平累積效果，導(dǎo)致其能被攜帶到動物體液，器官和組織中，最后使動物中毒甚至死亡[15]。在生活中最常見的真菌毒素是黃曲霉毒素，它主要是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類具有強毒性和強致癌性的二氫呋喃香豆素衍生物。目前已經(jīng)鑒定確認(rèn)的黃曲霉毒素有 28 種，它們具有較為類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中最為主要的有 4 種：AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2（如圖 1-1）[2, 16]。黃曲霉根據(jù)菌核直徑大小可以分為 L 型（大于 400 m）和 S 型（小于 400 m），其中 L 型黃曲霉只能產(chǎn)生 AFB1和 AFB2兩種黃曲霉毒素，而 S 型黃曲霉能產(chǎn)生 AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2四種黃曲霉毒素[17, 18]。

圖 2-1 不同真菌中 PKS1 同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析。Figure 2-1. Phylogenetic analysis of PKS1 homologous protein from different fungi.然后利用 antiSMASH 在線分析預(yù)測黃曲霉 pks1 基因所在基因簇，獲得預(yù)測的黃曲霉分生孢子色素合成基因簇基因類型及結(jié)構(gòu)。通過與米曲霉、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉等 5 個菌種同源基因簇分析比對，發(fā)現(xiàn)該基因簇與米曲霉同源基因簇高度保守，且合成骨架基因 pks1 有 99%的相似度，與黑曲霉 albA（ANI_1_726084）、煙曲霉 alb1（AFUA_2G17600）和構(gòu)巢曲霉 wA（AN8209）三個黑色素生物合成基因相似性均在 73%以上，但與非曲霉屬的真菌無花果擬盤多毛孢的黑色素生物合成骨架基因 PfmaE（PFICI_07101）的相似性僅為 44%（圖 2-2 和附表 1）。上述結(jié)果分析可得，黃曲霉分生孢子色素合成途徑應(yīng)類似于黑色素的 DHN 合成途徑。

圖 2-2 黃曲霉分生孢子色素合成基因 pks1 基因簇的同源性比對Figure 2-2. Homologue alignment of pks1 cluster in A. flavus.2.3.2 黃曲霉分生孢子色素合成基因 pks1 敲除菌株的構(gòu)建與驗證利用通過生物信息學(xué)分析，確認(rèn)了分生孢子色素合成骨架基因為 pks1。本研究利用同源重組替換的方式敲除目標(biāo)基因，獲得敲除菌株 Δpks1，通過與野生型菌株分析對比兩者差異性。敲除原理如圖 2-3A 所示，本實驗使用 double-joint技術(shù)手段獲得用于同源重組的融合片段[98]。通過 PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將融合片段導(dǎo)入到黃曲霉 CA14 PTs 中。之后利用 pyrG 標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子，多次篩選后，提取轉(zhuǎn)化子基因組 DNA 使用三對引物篩選正確的轉(zhuǎn)化子。因引物位于目標(biāo)基因內(nèi)部，擴增出條帶 P1 則能證明目的基因未能敲除成功。之再使用引物進(jìn)一步擴增條帶 P2 和 P3，能確認(rèn)轉(zhuǎn)化子成功敲除目標(biāo)基因。如圖 2-3B 所示，轉(zhuǎn)化子無法擴增出條帶 P1，能擴增出目標(biāo)條帶 P2 和 P3，證明轉(zhuǎn)化子是陽性轉(zhuǎn)化子，而野生型則與之相反。PCR 結(jié)果圖所示獲得 3 個陽性轉(zhuǎn)化子并用于后續(xù)試驗研究。

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本文編號：2819170