束縛-浸水應(yīng)激(restraint water-immersion stress,RWIS)是一種生理和心理上的復(fù)合型應(yīng)激,可在短時(shí)間內(nèi)誘發(fā)胃腸機(jī)能紊亂(如胃運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)、胃酸分泌增多、胃粘液分泌減少、胃粘膜損傷和腸運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)等)。內(nèi)側(cè)前額葉(medial prefrontal cortex,mPFC)是哺乳動(dòng)物最高級(jí)別的聯(lián)合皮層,具有思考記憶、整合信息以及指揮調(diào)控的功能。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激1h大鼠mPFC內(nèi)Fos蛋白陽性表達(dá)明顯增多,表明mPFC核團(tuán)參與RWIS了過程。那么,在RWIS過程中mPFC內(nèi)有哪些蛋白發(fā)生了變化?這些差異蛋白參與RWIS調(diào)控的可能信號(hào)通路及分子機(jī)制是什么?這些問題仍沒有得到解決。此外,突觸可塑性對(duì)于神經(jīng)元和神經(jīng)環(huán)路的穩(wěn)定具有重要作用。在RWIS過程中,mPFC的突觸可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生怎樣的改變?nèi)砸娢从性敿?xì)報(bào)道。鑒于此,我們提出以下三個(gè)問題:1.RWIS導(dǎo)致大鼠mPFC內(nèi)哪些蛋白的表達(dá)量發(fā)生改變?這些差異蛋白參與調(diào)控的可能機(jī)制及信號(hào)通路如何?2.RWIS大鼠mPFC內(nèi)神經(jīng)元突觸的超微結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變?3.RWIS大鼠mPFC內(nèi)突觸相關(guān)的標(biāo)志性功能蛋白是否發(fā)生改變?為探索上述三個(gè)問題,設(shè)計(jì)以下三部分實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)一:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(RWIS 0h)和實(shí)驗(yàn)組(RWIS 4h),用同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)分析兩組間大鼠mPFC內(nèi)差異表達(dá)蛋白,進(jìn)而對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析、KEGG分析和IPA分析,探索這些差異蛋白在應(yīng)激過程可能參與的信號(hào)通路以及分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)二:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組,即RWIS 0h(對(duì)照組)、RWIS 1h、RWIS 2h和RWIS 4h組。用高爾基染色法檢測(cè)RWIS不同時(shí)間段mPFC內(nèi)神經(jīng)元樹突棘密度的變化,用透射電鏡超薄切片技術(shù)觀察RWIS不同時(shí)間段mPFC內(nèi)PSD厚度、突觸間隙的寬度、突觸曲率以及突觸數(shù)密度等突觸超微結(jié)構(gòu)的變化,探究RWIS不同時(shí)間段大鼠mPFC內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生了怎樣的改變。實(shí)驗(yàn)三:分組情況同實(shí)驗(yàn)二。分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)、RTPCR技術(shù)檢測(cè)應(yīng)激不同時(shí)間段突觸標(biāo)志物——突觸后致密物蛋白PSD-95與突觸膨體素SYN蛋白及其mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化,進(jìn)而分析RWIS不同時(shí)間段大鼠mPFC的突觸功能可塑性是否發(fā)生改變以及發(fā)生了怎樣的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1.iTRAQ技術(shù)共鑒定出對(duì)照組與RWIS 4h兩組差異蛋白129種,其中有88種上調(diào)、41種下調(diào)。GO分析表明22%(29個(gè))的差異蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)功能直接相關(guān),包括突觸可塑性(6個(gè))、軸突形態(tài)和生長(zhǎng)(12個(gè))、神經(jīng)發(fā)育與凋亡(10個(gè))和神經(jīng)信號(hào)傳遞(1個(gè))等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)129種差異蛋白共富集到64條代謝通路,涉及突觸囊泡循環(huán)、毒理代謝等過程。IPA分析差異蛋白參與137條信號(hào)通路,其中只有Rho-GDI信號(hào)通路被抑制,整合素信號(hào)通路被激活。2.束縛-浸水應(yīng)激改變了大鼠mPFC的突觸結(jié)構(gòu)可塑性。樹突棘染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各應(yīng)激組與對(duì)照組相比單位長(zhǎng)度(10um)內(nèi)樹突棘的數(shù)量均有顯著性減少(P0.05)。隨著RWIS時(shí)間的延長(zhǎng),樹突棘的密度整體呈先下降再恢復(fù)的趨勢(shì)。其中RWIS 1h組樹突棘密度最低(P0.01),RWIS 2h與RWIS 4h組較RWIS 1h組樹突棘的密度有所升高,但無顯著性差異(P0.05)。電鏡下可以觀察到清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu),如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體以及突觸等。突觸后部位電子致密物質(zhì)明顯增厚,在突觸前終末端有或多或少的囊泡,呈圓形或橢圓形,聚集在突觸前膜處,同時(shí)還可以觀察到部分與突觸前膜融合的囊泡。突觸活性區(qū)的長(zhǎng)度以及突觸后致密帶的厚度和長(zhǎng)度也各有不同。對(duì)照組細(xì)胞成分輪廓清晰,而應(yīng)激組輪廓欠清晰,穿孔型突觸較多,可以觀察到空泡化的線粒體,這說明氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)線粒體造成了一定損傷。與對(duì)照組相比,RWIS 4h組單位面積突觸的數(shù)量顯著減少(P0.05),RWIS 1h和RWIS 2h組與對(duì)照組相比突觸數(shù)目有所減少,但差異均不顯著(P0.05)。與對(duì)照組相比,RWIS 4h組平直型突觸和U型突觸所占比例顯著減少(P0.05),而倒U型突觸所占的比例顯著上升(P0.05),RWIS 2h和RWIS 1h組與對(duì)照組相比均差異不明顯(P0.05)。RWIS 4h組突觸前囊泡的數(shù)量較對(duì)照組明顯減少(P0.05),RWIS 1h和RWIS2h組較對(duì)照組則無顯著性差異(P0.05)。突觸間隙的寬度隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先減小后又回增的趨勢(shì),其中RWIS 1h和RWIS 2h組較RWIS 0h組突觸間隙的寬度均顯著降低(P0.05),但RWIS 4h組與對(duì)照組相比則無顯著差異(P0.05)。應(yīng)激不同時(shí)間段,各組PSD的厚度較對(duì)照組均有顯著性降低(P0.05),隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),PSD的厚度呈現(xiàn)先降低后恢復(fù)的趨勢(shì)。其中,在RWIS 2h組PSD厚度最低(P0.01),RWIS 4h組PSD厚度與RWIS 1h和RWIS 2h組相比有升高的趨勢(shì),但無顯著性差異(P0.05)。3.束縛-浸水應(yīng)激改變了大鼠mPFC的突觸功能可塑性。免疫組化結(jié)果顯示PSD-95蛋白主要在胞漿及膜表面表達(dá),呈棕色或者棕黃色。隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),PSD-95陽性胞體數(shù)量呈現(xiàn)先降低后又恢復(fù)的趨勢(shì),且各應(yīng)激組PSD-95陽性胞體數(shù)量均較對(duì)照組均有顯著性減少(P0.05)。其中RWIS 1h組PSD-5陽性表達(dá)量數(shù)量最低(P0.01),RWIS 2h和RWIS 4h組與RWIS 1h組相比,PSD-95表達(dá)量有所上升,但與RWIS 1h組無顯著性差異(P0.05)。SYN在整個(gè)胞質(zhì)中均有表達(dá),呈棕黃色。RWIS 4h組與對(duì)照組相比,SYN的表達(dá)量顯著下降(P0.05),而RWIS 1h和RWIS 2h組與對(duì)照組相比略有上升,但無顯著性差異(P0.05)。免疫印跡結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,PSD-95表達(dá)整體呈先降低再升高的趨勢(shì)。應(yīng)激組與對(duì)照組相比,PSD-95相對(duì)表達(dá)量均有所降低,并具有顯著性差異(P0.05)。其中,RWIS 1h組PSD-95條帶相對(duì)表達(dá)量最低(P0.01),RWIS 2h和RWIS 4h組較RWIS1h組PSD-95的表達(dá)量增多,但無顯著性差異。SYN的表達(dá)整體呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。RWIS 4h組SYN的相對(duì)表達(dá)量最低,與應(yīng)激組相比有顯著性差異(P0.05),RWIS 1h組與RWIS 4h組較對(duì)照組SYN的表達(dá)略有上升,但無顯著性差異。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SYN蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量與免疫組化和免疫印跡結(jié)果一致,RWIS 4h組與RWIS 0h組相比,mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),RWIS 1h和RWIS 2h組與對(duì)照組相比有減少趨勢(shì),但無顯著性差異(P0.05)。與對(duì)照組相比,RWIS 1h和RWIS 2h組PSD-95蛋白mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),RWIS 4h組mRNA卻表達(dá)無顯著差異(P0.05)。RWIS 4h組與RWIS 2h組相比,PSD-95蛋白mRNA表達(dá)下降(P0.05),但與RWIS 1h組相比無顯著性差異(P0.05)。綜合以上實(shí)驗(yàn),RWIS不同時(shí)間段對(duì)大鼠mPFC內(nèi)神經(jīng)元形成一定程度損傷,mPFC內(nèi)突觸可塑性下調(diào)。差異蛋白參與了氧化應(yīng)激、毒理代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯以及細(xì)胞凋亡等生物過程,尤其是NDRG1和NYAP2蛋白在應(yīng)激中可能參與了機(jī)體的保護(hù)機(jī)制。隨RWIS時(shí)間的延長(zhǎng),機(jī)體啟動(dòng)應(yīng)激損傷調(diào)控機(jī)制,mPFC內(nèi)Rho-GDI信號(hào)通路的抑制和整合素信號(hào)通路的上調(diào)激活可能在神經(jīng)元的損傷修復(fù)以及突觸重塑過程中發(fā)揮重要功能。
【學(xué)位單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q42
【部分圖文】：

表 1- 2 大鼠 mPFC 中蛋白濃度與吸光值ug 進(jìn)行以下處理：，60℃反應(yīng) 60 min。號(hào) 吸光值 濃度（0.7543 50.5659 40.7242 50.4863 3圖 1- 1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度與紫外吸收值標(biāo)準(zhǔn)曲線

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文以上變化，P<0.05 為差異蛋白選取標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出差異蛋白 129 組相比，有 88 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，41 種表達(dá)下調(diào)。其中 22%（系統(tǒng)功能直接相關(guān)，包括突觸可塑性（6 個(gè)）、軸突形態(tài)和生長(zhǎng)（（10 個(gè)）和神經(jīng)信號(hào)傳遞（1 個(gè)）。果鑒定及表達(dá)差異分析

山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 樹突棘染色Hito 試劑盒染色樹突棘實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比單位長(zhǎng)度內(nèi)（10um）樹突棘的密度呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組樹突棘的密度均有顯著性減少（P<0.05）。其中 RWIS1h 組，樹突棘密度最低（P<0.01）。RWIS 2h 與 RWIS 4h 組與 RWIS 1h 組相比，樹突棘的密度有上升的趨勢(shì)，但無顯著性差異（P>0.05）。

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1 朱旭紅;張萍淑;程贊贊;孟燕;張利平;元小冬;;突觸可塑性相關(guān)蛋白及其與臨床疾病的關(guān)系[J];華北理工大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年03期

2 范鳴s

本文編號(hào)：2817492