Harpin蛋白是由hrp基因編碼的抗病激活蛋白,也是一種耐熱蛋白,通過革蘭氏陰性植物病原細菌Ⅲ型泌出系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)分泌,既能誘導非寄主植物產生過敏性壞死反應(Hypersensitive response,HR),同時其本身又是病原菌的一種致病因子。目前國內外對Harpin蛋白的作用機制已有深入研究,但對于它的耐熱機制尚未見專門的研究報道。為了研究HarpinX的耐熱機制,本研究以來自黃單胞菌的HpaXm、Hpa1Xoo、HpaXam和HpaXcm為材料,利用生物信息學技術深入分析了蛋白結構特征;通過煙草葉片表型試驗和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術,從表觀和微觀兩方面探索了高溫對蛋白功能的影響;通過檢測蛋白吸光度和圓二色(Circular dichroism,CD)光譜,探究了高溫對蛋白結構的影響:利用定點突變技術對蛋白coiled-coil(CC)結構進行改造,驗證了 CC結構與蛋白熱穩(wěn)定性的關系。主要研究結果如下:1.通過煙草葉片HR表型試驗分析比較4種HarpinX蛋白的熱穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)高溫對Hpa1Xoo和HpaXcm的HR活性影響不明顯,說明熱穩(wěn)定性較好;高溫使得HpaXm和HpaXam的HR活性明顯下降,說明熱穩(wěn)定性較差。2.通過檢測蛋白吸光度,發(fā)現(xiàn)HarpinX吸光度隨處理溫度的增加而上升,推測高溫使包埋在結構內部的苯丙氨酸逐漸暴露,蛋白結構逐漸展開。通過CD光譜檢測二級結構含量,發(fā)現(xiàn)高溫處理后HarpinX的α-螺旋含量增加至接近100%。進一步證實高溫使HarpinX的蛋白結構發(fā)生變化,促進其他二級結構向α-螺旋轉化。3.通過表型試驗發(fā)現(xiàn),HarpinX的HR活性隨高溫變化不明顯。利用qRT-PCR對NtEXP6、Hin1、HSR203J、NPR1、PR-1a表達情況進行檢測,發(fā)現(xiàn)高溫使各基因表達量發(fā)生了不同程度的變化。推測HarpinX的耐熱性與蛋白空間結構關系微弱,但蛋白誘導基因表達的能力與蛋白空間結構關系密切。4.利用生物信息學對蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)在HarpinX蛋白N末端的α-螺旋區(qū)域都能夠形成CC結構,但形成的可能性各有不同。利用定點突變技術改造CC結構,成功獲得突變體 HpaXmAL39A、HpaXmAD40A、Hpa1XooAL40A、Hpa1Xoo△D41A、HpaXam△L44A、HpaXamAM54L、HpaXcmAL40A 和 HpaXcmAD41A。通過 Western blot發(fā)現(xiàn),HpaXam的Leu44對蛋白可溶性表達至關重要。結合CC結構預測結果發(fā)現(xiàn),若破壞CC的形成,相應突變體的熱穩(wěn)定性隨之變弱;反之,若加強CC的形成,相應突變體的熱穩(wěn)定性隨之增強。5.綜合以上結果推測,高溫使HarpinX的空間結構逐漸展開,但蛋白的HR活性具有耐熱性,可能是由于高溫無法破壞蛋白的氨基酸序列,所以序列中heptad的關鍵氨基酸仍能夠通過疏水作用力形成CC結構,因此高溫處理后的HarpinX蛋白仍然能與煙草葉片中的互作蛋白進行互作,從而產生HR壞死斑。對HarpinX蛋白的耐熱機制進行初探,不僅為深入研究Harpin蛋白的作用機理奠定基礎,也為改造工業(yè)上非耐熱蛋白提供理論依據(jù)。
【學位單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S432.1
【部分圖文】：

旋相互作用模型示意圖（石劉飛，２０ｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａ－ｈｅｌｉｃｅｓ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ體；Ｂ：三聚體；Ｃ：四聚體；Ｄ：ｅｒ；邋Ｂ：邋Ｔｒｉｍｅｒ；邋Ｃ：邋Ｔｅｔｒａｍｅｒ；邋Ｄ：邋Ｈｅｘａ一個單體，ａｂｃｄｒｆｇ為ｈｅｐｔａｄ邋ｒｅｐｅａｔｒｅｓｅｎｔｓ邋ａ邋ｓｉｎｇｌｅ，邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｗ構特征，隨著研究的不斷深入，面。利用ＣＣ結構結合親和層析用Ｅ３／Ｋ３的ＣＣ結構來共純２０１２）。目前，根據(jù)此原理己經方面，利用ＣＣ結構進行藥物的實現(xiàn)藥物緩釋效果，避免藥物對上識別到活性蛋白和受體（Ｌｅｅｔａｌ．加以運用，Ｃｈａｏ等人設計合成的

圖７邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白ｃｏＨｅｄ－ｃｏｉｌ結構的預測逡逑Ｆｉｇ．７邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨａｒｐｉｎＸ逡逑．１．５邋ＨａｒｐｉｎＸ蛋白的三級結構預測逡逑三維結構模型表明，ＨａｒｐｉｎＸ的結構中均有兩個主要的ａ－螺旋（圖８）ｅｕ４２、Ｌｅｕ４６邋和邋Ａｌａ４９邋是形成邋ＨｐａＸｍ邋中邋ＣＣ邋結構的關鍵氨基酸，Ｌｅｕ４０、ＬｅＡｌａ５０是形成ＨｐａｌＸｏｏ中ＣＣ結構的關鍵氨基酸，Ｌｅｕ４４、Ｌｅｕ４７、Ｌｅｕ５１形成ＨｐａＸａｍ中ＣＣ結構的關鍵氨基酸，Ｌｅｕ４０、Ｌｅｕ４３、Ｌｅｕ４７和ＡｌａｐａＸｃｍ中ＣＣ結構的關鍵氨基酸（圖８），而這些氨基酸都位于心螺旋的）0逡逑

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【參考文獻】

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本文編號：2814136