vlf-1是桿狀病毒AcMNPV的核心基因之一,也是病毒感染的必需基因,其同源序列存在于所有已測序的桿狀病毒中。最初的研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白影響極晚期基因的超表達,因此命名為極晚期表達因子1(very late expression factor 1,VLF-1)。后來研究發(fā)現(xiàn)VLF-1對病毒核衣殼形成是必需的,該基因缺失突變病毒能觀察到空管狀衣殼鞘結(jié)構(gòu),表明VLF-1參與了病毒核衣殼的組裝。vlf-1突變病毒的基因組DNA能被DNA酶完全降解,而其他某些病毒基因缺失也產(chǎn)生空管狀衣殼鞘的病毒,其病毒基因組DNA有大約35%被保護而不被DNA酶降解,這表明VLF-1可能參與調(diào)控病毒基因組DNA的包裹。另外,VLF-1作為核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白,定位于核衣殼的末端。因此,VLF-1在病毒DNA加工、包裹和核衣殼組裝的最后階段有關(guān)鍵作用。本實驗從兩個方面對VLF-1的功能進行更深一步的研究。一、通過對VLF-1蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測,依據(jù)保守型結(jié)構(gòu)域、整合酶家族結(jié)構(gòu)域、DNA斷裂-再連接酶結(jié)構(gòu)域以及蛋白、DNA、RNA結(jié)合位點對vlf-1基因序列進行針對性的截短,在Bac-to-Bac系統(tǒng)中構(gòu)建了十二個截短型和拯救型重組桿狀病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Sf9細胞,使用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡觀察重組病毒在細胞中的復(fù)制情況,分析截短型VLF-1對病毒復(fù)制的影響。二、通過酵母雙雜交的手段,構(gòu)建AcMNPV感染的Sf9細胞總cDNA文庫,利用結(jié)合法篩選,再利用缺陷型培養(yǎng)基逐步驗證與VLF-1互作的蛋白。在得出初步結(jié)果后利用CO-IP、雙分子熒光互補等技術(shù),進一步驗證互作蛋白。最后通過亞細胞定位等方式來探究其在細胞中互作的位置。以此來探究VLF-1調(diào)控病毒核衣殼組裝及極晚期轉(zhuǎn)錄的機制。實驗結(jié)果表明,在一系列截短型重組病毒中,堿基序列為1-1044 bp的截短型在Sf9細胞中的復(fù)制和感染情況與野生型和拯救型類似,說明其關(guān)鍵功能域存在于該區(qū)域。而在互作蛋白的篩選中,初步篩選出19種可能與VLF-1互作的蛋白,并挑選出以下由AcMNPV編碼的蛋白:39K(Ac36)、VLF-1(Ac77)、CG30(Ac88)、VP39(Ac89)、LEF-5(Ac99)、P6.9(Ac100)、ME53(Ac139),進行深入驗證。驗證結(jié)果表明 39K(Ac36)、CG30(Ac88)、LEF-5(Ac99)與VLF-1存在互作。亞細胞共定位實驗表明,39K與VLF-1共定位于細胞核。亞細胞定位實驗表明,39K定位于細胞核;CG30定位于細胞核膜;LEF-5定位于細胞核。其中,39K是一個能與單鏈和雙鏈DNA結(jié)合的蛋白;CG30含有一個鋅指和亮氨酸指的結(jié)構(gòu),刪除該蛋白后病毒的滴度急劇下降;LEF-5是一個晚期表達因子,含有一個類似于RNA聚合酶II延伸因子(TFIIS)的結(jié)構(gòu)域,主要功能是調(diào)節(jié)晚期基因轉(zhuǎn)錄。我們推測VLF-1可能通過與39K相互作用參與病毒DNA的加工;通過與CG30的互作參與核衣殼的組裝;通過與LEF-5的互作調(diào)控極晚期基因的超表達。其具體的作用機制仍有待闡明。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

其膜融合蛋白為Ｆ蛋白［ｉｙ。另外，根據(jù)桿狀病毒包埋型病毒（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｖｉｒｕｓ，逡逑ＯＤＶ）粒子囊膜包裹的核衣殼數(shù)，ＮＰＶ可被分為多粒包埋型（ＭＮＰＶ）和單粒包埋型（ＳＮＰＶ）逡逑（圖１－１）；邋ＧＶ同樣也存在單粒和多粒包埋型，但是多粒包埋型相當稀少。多粒包埋和逡逑單粒包埋只是形態(tài)的區(qū)別，并不是分類的依據(jù)。逡逑

ＡｃＭＮＰＶ作為模式種，其基因組于１９９４年第一個被測出。測序結(jié)果表明，其基因組逡逑大小為１３３．９８４邋ｋｂ，編碼序列達９１邋％，有１５４個ＯＲＦ［２７］，其中的２９個基因是核心基因，逡逑是病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組裝所必需的。ＡｃＭＮＰＶ基因組物理圖譜如圖１－４所示。逡逑

圖１４ＡｃＭＮＰＶ基因組物理圖譜逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＡｃＭＮＰＶ逡逑基因逡逑病毒基因同源性分析，發(fā)現(xiàn)在己測序的所有桿狀病毒中均存在一些共有的因，稱為核心基因。核心基因?qū)τ诓《荆模危翉?fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、核增殖的必需步驟至關(guān)重要。目前已發(fā)現(xiàn)３０個核心基因【２８－３％分別為：與病毒基因，如＜２Ｃ（５５，ａｃ９５，／￥？／，與基因轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)基因，如／？４７，／８，Ｉｅｆ－９；與病毒組裝相關(guān)基因，如邋ｐ６．９，邋ｖｐ３９，邋ｖ！ｆ－Ｊ，邋ｄｅｓｍｏｐ，邋ｏｄｖ－ｅ２７，邋ａ！ｋ－６１，ｐ９５，ｖｐｌ０５４，ｇｐ４０，３８ｋ，ａｃｌ０９，ａｃｌ０３，ａｃ９２，ｏｄｖ－ｅ２５，ｏｄｖ－ｅＩ９，ａ毒感染相關(guān)基因，如／？７４。這些生命周期中起著關(guān)鍵性的作用［３１］。逡逑表達的時序性逡逑病毒基因在宿主細胞內(nèi)的表達具有明顯的時序性，依據(jù)表達時間可將病毒

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本文編號：2812706