紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上重要的多年生優(yōu)質牧草,具有產量高、品質好的特點。然而,由于全世界范圍內干旱和鹽脅迫災害的日益加劇,其生長范圍受到嚴重限制。隨著分子育種的興起,利用生物工程技術培育適應不良環(huán)境的新型作物,這為紫花苜蓿育種在抗旱、抗鹽方面提供了理論依據。表皮蠟質是覆蓋在植物表面的角質層組成部分。蠟質的積累與防止水分散失相關,有助于抗旱耐鹽。而植物蠟質由超長鏈脂肪酸(Very Long Chain Fatty,VLCFAs)和其他衍生物共同組成。在超長鏈脂肪酸合成中,主要由復合酶——脂肪酰輔酶A延長酶(Fatty Acyl-enzyme A)催化完成。3-酮脂酰輔酶A合成酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)作為復合酶FAE中的限速酶,在下游產物的合成中起關鍵作用。本文基于RACE技術,從紫花苜蓿中克隆一個基因MsKCS10,從該基因功能、特性方面進行了研究。研究結果如下:1.利用實驗室前期基因芯片數(shù)據,使用PCR方法從紫花苜蓿葉片中克隆KCS10中間片段序列。采用RACE技術,擴增該中間片段得到基因全長,命名為MsKCS10。測序結果表明,其基因全長(gene full length)為1889bp,開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)共1614bp,能編碼氨基酸537個,GeneBank登錄號為MK625177。序列比對后發(fā)現(xiàn),該MsKCS10基因與蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性為98.36%。利用neighbor-joining方法構建系統(tǒng)進化樹,其分析表明MsKCS10基因和蒺藜苜蓿KCS10基因的同源性最高。使用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其在各組織間的表達情況,結果表明:MsKCS10主要在葉和莖中表達,在根中幾乎不表達。另外,利用RT-qPCR技術分析MsKCS10基因在9個品種的紫花苜蓿地上部分的表達情況。此外,該基因的轉錄表達還受逆境脅迫誘導,分析表明,在干旱條件下,MsKCS10上調較快,而在鹽脅迫下,上調緩慢。2.構建瞬時表達載體pCAMBIA1300-MsKCS-GFP,使用農桿菌介導法注射在煙草葉片上進行亞細胞定位研究,結果表明,該基因定位在內質網上;構建過表達載體pCAMBIA1301-MsKCS,利用農桿菌介導及葉盤法,侵染煙草,組培后經檢測成功獲得MsKCS10過表達煙草。過表達植株經自然光干旱脅迫、補充光照干旱和鹽脅迫后,其生理生化指標均優(yōu)于對照組。此外,在煙草葉片中過表達MsKCS10,發(fā)現(xiàn)直鏈烷烴含量和脂肪酸含量增加。且直鏈烷烴含量的增加主要集中在C31和C33烷烴;脂肪酸含量的增加集中在C20和C22脂肪酸,說明MsKCS10參與煙草蠟質合成,并參與脫羰途徑。掃描電鏡結果發(fā)現(xiàn),轉基因煙草葉片上出現(xiàn)特殊形態(tài)的螺旋狀蠟質晶體。葉綠素浸出試驗數(shù)據表明,轉基因煙草葉綠素浸出速率小于對照組。同時葉片失水速率試驗測定表明,轉基因煙草葉片的保水能力優(yōu)于對照組3.基于GenBank果實特異性啟動子PG基因的啟動子區(qū)域設計特異引物,從Monkey-Maker番茄基因組中克隆番茄果實特異性啟動子PG,構建果實特異啟動子過表達載體PBI121-PG promoter-MsKCS,使用農桿菌介導法導入Micro-Tom番茄中,經植物組織培養(yǎng)和PCR檢驗,獲得MsKCS10轉基因番茄。試驗后發(fā)現(xiàn),轉基因Micro-Tom番茄較對照組更耐存放。轉基因番茄果皮蠟質的直鏈烷烴及脂肪酸和醛類物質增加。說明MsKCS10在轉基因的番茄果實表皮的蠟質合成中,與在煙草葉片中一樣,均參與脫羰途徑。此外經電鏡掃描后發(fā)現(xiàn),轉基因番茄表皮出現(xiàn)同轉基因煙草葉片表皮相同的特殊蠟質晶體,這可能是由于直鏈烷烴及脂肪酸含量增加的共同作用;4.使用In-fusion構建過表達載體pCABIAM3301-MsKCS和采用Gateway方法構建得到干擾載體pK7GWIWG2-MsKCS。利用農桿菌介導法,經組織培養(yǎng)和檢測,獲得MsKCS10過表達紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干擾紫花苜蓿。對MsKCS10過表達紫花苜蓿和MsKCS10-RNAi干擾紫花苜蓿進行電鏡掃描后發(fā)現(xiàn),過表達苜蓿葉片表皮蠟質晶體有更濃密的片狀蠟質結晶,干擾紫花苜蓿具有較稀疏的片狀蠟質結晶。此外,過表達MsKCS10基因苜蓿有更高的C30醇含量、直鏈烷烴含量;RNAi-MsKCS10轉基因苜蓿則表現(xiàn)出下降的C30醇含量、直鏈烷烴含量,說明MsKCS10在轉基因紫花苜蓿葉片的蠟質合成中,既參與脫羰途徑又參與�；�原途徑。綜上所述,MsKCS10主要響應植物干旱脅迫,并且在轉基因煙草葉片和番茄果實表皮的蠟質合成中,均參與脫羰途徑。另外,在轉基因煙草和轉基因番茄果皮都出現(xiàn)螺旋狀蠟質晶體沉淀,結合二者蠟質組分,這可能是由于直鏈烷烴及脂肪酸含量增加的共同作用。而MsKCS10在轉基因紫花苜蓿葉片的蠟質合成中,既參與脫羰途徑又參與�；�原途徑。
【學位單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S541.9;Q943.2
【部分圖文】：

6圖 1-1 表皮蠟晶體的主要類型示意圖.re 1-1 The schematic drawing of the main types of plant epicuticular wB，殼狀型；1C，裂紋型；1D，顆粒型；1E，小板型；1F，膜狀角狀棒狀；2C，多邊形棒狀；2D，盤繞棒狀；2E，橫向脊型棒醇管狀；3B，二酮管狀；3C，花狀小板型；3D，平行小板狀；小板狀；3F，縱向棒狀 (Barthlott et al. 1998)

技術路線

X（https://blast.ncbi.nlm.neb.expasy.org/compute_p樹；使用 ProtScale（htt 性 / 疏 水 性 bin/npsa_automat.pl?page=tps://www.swissmodel.exp，驗證其是否為 KCS 基因 質量檢查al RNA使用酶標儀測定O，無蛋白污染。經 1.0%A 可用于后續(xù)反轉錄試驗

【相似文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 劉雨詩;紫花苜蓿3-酮酰輔酶A合成酶基因（MsKCS10）的克隆與功能分析[D];西北農林科技大學;2019年

本文編號：2811415